反芻動(dòng)物用飼料中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

T/SXSLXXX-2023反芻動(dòng)物用飼料中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了反芻動(dòng)物用飼料中氯酸鹽和高氯酸鹽的液相色譜-質(zhì)譜法測定方法。本文件適用于反芻動(dòng)物用青貯飼料、精料補(bǔ)充料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料中氯酸鹽和高氯酸鹽含量的測定。本文件氯酸鹽的檢出限為2.0ug/kg，定量限為5.0ug/kg；高氯酸鹽的檢出限為1.0ug/kg，定量限為2.5ug/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理試樣中的氯酸鹽和高氯酸鹽用0.1%甲酸甲醇溶液提取，青貯飼料經(jīng)HLB固相萃取柱和GCB固相萃取柱凈化，精料補(bǔ)充料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線校準(zhǔn)，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用色譜純試劑。5.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2乙腈。2T/SXSLXXX-20235.5甲酸銨。5.60.1%甲酸甲醇溶液：移取1mL甲酸于1000mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻。5.720mmol/L甲酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取1.26g甲酸銨于1000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻，過0.22μm濾膜后備用。5.8氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1mg/mL）：以氯酸根（ClO3-）計(jì)，CAS:7775-09-9。5.9高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1mg/mL）：以高氯酸根（ClO4-）計(jì)，CAS:7601-89-0。5.10氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)貯備液（1mg/mL）：以氯酸根-18O3（ClO3-18O3）計(jì)，CAS:14866-68-3。5.11高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)貯備液（1mg/mL以高5.12混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別準(zhǔn)確移取氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5.8）2mL、高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)1mL于同一10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，制成氯酸鹽、高氯酸鹽濃度分別為200.0μg/mL、100.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，4℃保存，有效期為3個(gè)月。5.13混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.12）0.1mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，制成氯酸鹽、高氯酸鹽濃度分別為2.0μg/mL、1.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4℃保存，有效期為1個(gè)月。5.14混合同位素內(nèi)標(biāo)中間溶液：分別準(zhǔn)確移取氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)貯備液（5.10）2mL、高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)貯備液（5.11）1mL于同一10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，制成氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)、高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)濃度分別為200.0μg/mL、100.0μg/mL的混合同位素內(nèi)標(biāo)中間溶液，4℃保存，有效期為3個(gè)月。5.15混合同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液：準(zhǔn)確移取混合同位素內(nèi)標(biāo)中間溶液（5.14）0.1mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，制成氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)、高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)濃度分別為2.0μg/mL、1.0μg/mL的混合同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，4℃保存，有效期為1個(gè)月。200μL及混合同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（5.15）50μL于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成氯酸鹽濃度為1.0ng/mL、2.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL，高氯酸鹽濃度為0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，氯酸根-18O3濃度為10.0ng/mL，高氯酸根-18O4濃度為5.0ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用現(xiàn)配。5.17HLB固相萃取小柱：規(guī)格為200mg/6mL，或者性能相當(dāng)者，臨用前用5mL甲醇活化。5.18GCB固相萃取小柱：規(guī)格為200mg/6mL，或者性能相當(dāng)者，臨用前用5mL甲醇活化。5.19微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。6儀器設(shè)備3T/SXSLXXX-20236.1液相色譜-質(zhì)譜儀（配有電噴霧電離源）。6.2分析天平：感量0.0001g和0.00001g。6.3渦旋混合器。6.4振蕩器。6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6000r/min。6.6固相萃取裝置。7樣品按照GB/T20195的規(guī)定制備樣品，粉碎后過0.42mm孔徑分析篩，混勻，裝入大磨口瓶中備用。選取與待測樣品類型相同，均勻一致，且在待測物保留時(shí)間處儀器響應(yīng)面積小于方法定量限30%的飼料樣品，作為空白樣品。8試驗(yàn)步驟8.1提取稱取試樣2g（精確至0.0001g）于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入50μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（5.15混勻；再準(zhǔn)確加入0.1%甲酸甲醇溶液10mL（5.6渦旋1min，振蕩提取20min，于6000r/min離心3min，上清液轉(zhuǎn)入另一支潔凈的離心管中，待凈化。8.2凈化8.2.1青貯飼料取GCB固相萃取小柱和HLB固相萃取小柱，將5mL待凈化液注入GCB固相萃取小柱中，使用注射器活塞加壓，棄去約1mL流出液，續(xù)濾液流入HLB固相萃取小柱中，使用注射器活塞加壓，棄去約1mL流出液，收集續(xù)濾液，過膜（5.20）后待測。8.2.1精料補(bǔ)充料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料取HLB固相萃取小柱，將5mL待凈化液注入HLB固相萃取小柱中，使用注射器活塞加壓，棄去約1mL流出液，收集續(xù)濾液，過膜（5.20）后待測。8.3測定8.3.1液相色譜參考條件色譜柱：AcclaimTMTrinityTMP1復(fù)合離子交換柱（100×2.1mm，3μm或性能相當(dāng)者。流動(dòng)相：A相：20mmol/L甲酸銨溶液（5.7B相：乙腈，洗脫條件見表1。流速：0.5mL/min。柱溫：35℃。4T/SXSLXXX-2023進(jìn)樣量：10μL。表1梯度洗脫條件8.3.2質(zhì)譜參考條件電離方式：電噴霧離子源（ESI檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM掃描方式：負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓：2.5kV；離子源溫度：150℃;脫溶劑氣溫度：350℃;多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量見表2。表2硝基咪唑類藥物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及質(zhì)譜條件V//8.3.3混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液和試樣溶液的測定在儀器最佳工作條件下，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（5.16）和試樣溶液（8.2）上機(jī)測定。混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中各被測物的選擇離子色譜圖參見附錄A。8.4.4定性測定5T/SXSLXXX-2023通過試樣色譜圖的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、各色譜峰的特征離子與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各色譜峰的特征離子相對(duì)照定性。試樣與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的相對(duì)偏差不大于5%；試樣特征離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過表3的規(guī)定，則可判定樣品中存在對(duì)應(yīng)的化合物。表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差單位為%>50±20±25±30±508.4.5定量取試樣溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比定量，標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中氯酸鹽、高氯酸鹽與其內(nèi)標(biāo)峰面積比均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中氯酸鹽、高氯酸鹽的含量w以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為毫克每千克(μg/kg按公式（1）計(jì)算。wi×n×..............................式中：Cis——試樣溶液中各內(nèi)標(biāo)物濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；Cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中各待測物濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；C’is——標(biāo)準(zhǔn)溶液中各內(nèi)標(biāo)物濃度，單位為納克每毫升（ng/mLAi——試樣溶液中各待測物峰面積；Ais——試