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DB41DB41/T1586—2018飼料中志賀氏菌的檢測(cè)EMA-PCR法2018-04-17發(fā)布2018-07-17實(shí)施河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I14.32×PremixTaq緩沖液：內(nèi)含TaqDNA聚合酶1.25a）上游引物：5＇-TTGCTGCTGATGCCACTGAGA-3';4.10疊氮溴化乙錠（EMA，0.2mg/mL見附錄A的A.4。4.11溴化乙錠（10mg/mL）。4.12滅菌離心管：1.5mL，15mL。25.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。上，鹵素?zé)粽丈湎缕毓?min，然后水浴煮沸10min，再將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中使其快速冷卻。渦旋混勻裂解物，12000r/min離心2min，收集上清液，作為PCR擴(kuò)增的模板（模板稱取1.5g瓊脂糖（4.5）加入100mL1×TAE電泳緩沖與1μL6×上樣緩沖液（4.9）混合后加入到上樣孔內(nèi)，設(shè)Marker2000（4.6）對(duì)照。5V/cm～8V/cm恒壓下電泳20min～30min。3如果志賀氏菌陽性對(duì)照的PCR產(chǎn)物在386bp處出現(xiàn)條帶（參見附錄B），同時(shí)陰性對(duì)照PCR產(chǎn)物于樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在386bp處出現(xiàn)條帶樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在386bp處未出現(xiàn)條帶，判定25g樣品中未檢出志賀氏菌。4培養(yǎng)基和試劑A.1.1成分20g1g2g5g0.5g4g1.5g5g水1000mLA.1.2制法A.2.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.2.2制法調(diào)節(jié)至pH8.3，定容至1L后，室溫保存。使用時(shí)稀釋50倍即為A.3.1成分0.5g0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06mL360mL5滅菌水640mLA.3.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL滅菌水中，加入溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF溶解，與甘油混合，定容至1000mL，分裝后4℃保存。A.4.1成分疊氮溴化乙錠5mg滅菌水25mLA.4.2制法5mg疊氮溴化乙錠溶于5mL滅菌水中，定容至25mL，充分

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