《造血干細(xì)胞》課件

造血干細(xì)胞夏育宏

HematopoieticStemCell（HSC）

2012.4造血干細(xì)胞的定義：造血干細(xì)胞（HematopoieticStemCell,HSC)是一小群具有高度的自我復(fù)制和多向分化潛能的最原始的造血細(xì)胞。通俗地講，造血干細(xì)胞是指尚未發(fā)育成熟的細(xì)胞，是所有造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的起源。因此是多功能干細(xì)胞，醫(yī)學(xué)上稱其為“萬用細(xì)胞”，也是人體的始祖細(xì)胞。干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，是機(jī)體的起源細(xì)胞，是形成人體各種組織器官的祖宗細(xì)胞。特征造血干細(xì)胞有兩個重要特征：

其一，高度的自我更新或自我復(fù)制能力；

其二，可分化成所有類型的血細(xì)胞。分裂方式

正常情況下，造血干細(xì)胞經(jīng)過不對稱性有絲分裂成兩個子代細(xì)胞。其中一個仍維持造血干細(xì)胞的全部特征，即自我更新(self-renewal)。自我更新使得干細(xì)胞池的大小(干細(xì)胞數(shù)量)和質(zhì)量維持不變，因而又稱為自我維持(self-maintenance)。另一個子細(xì)胞可能由于基因表達(dá)模式發(fā)生改變而使得細(xì)胞特征出現(xiàn)變化，從而逐步走上分化的道路。

現(xiàn)已知道，造血干細(xì)胞不是純一的細(xì)胞群體，而是由不同年齡等級的干細(xì)胞組成。這些不同年齡等級的干細(xì)胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表達(dá)不一，生物學(xué)特性也有一定的差異。造血原理

人類造血干細(xì)胞首先出現(xiàn)于胚齡第2～3周的卵黃囊，在胚胎早期（第2～3月）遷至肝、脾，第5個月又從肝、脾遷至骨髓。在胚胎末期一直到出生后，骨髓成為造血干細(xì)胞的主要來源。具有多潛能性，即具有自身復(fù)制和分化兩種功能。在胚胎和迅速再生的骨髓中，造血干細(xì)胞多處于增殖周期之中；而在正常骨髓中，則多數(shù)處于靜止期（G0期），當(dāng)機(jī)體需要時，其中一部分分化成熟，另一部分進(jìn)行分化增殖，以維持造血干細(xì)胞的數(shù)量相對穩(wěn)定。

造血干細(xì)胞進(jìn)一步分化發(fā)育成不同血細(xì)胞系的定向干細(xì)胞。定向干細(xì)胞多數(shù)處于增殖周期之中，并進(jìn)一步分化為各系統(tǒng)的血細(xì)胞系，如紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系、單核-吞噬細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系以及淋巴細(xì)胞系。

由造血干細(xì)胞分化出來的淋巴細(xì)胞有兩個發(fā)育途徑，一個受胸腺的作用，在胸腺素的催化下分化成熟為胸腺依賴性淋巴細(xì)胞，即T細(xì)胞；另一個不受胸腺，而受腔上囊（鳥類）或類囊器官（哺乳動物）的影響，分化成熟為囊依賴性淋巴細(xì)胞或骨髓依賴性淋巴細(xì)胞，即B細(xì)胞。并分別由T、B細(xì)胞引起細(xì)胞免疫及體液免疫。如機(jī)體內(nèi)造血干細(xì)胞缺陷，則可引起嚴(yán)重的免疫缺陷病。

造血干細(xì)胞來源一般造血干細(xì)胞來源于：外周造血干細(xì)胞。骨髓造血干細(xì)胞。臍帶血造血干細(xì)胞。胎盤來源造血干細(xì)胞中華骨髓庫目前主要開展外周血造血干細(xì)胞采集。目前，全國只有漢氏聯(lián)合開展采集胎盤造血干細(xì)胞，并且獲得國家相關(guān)專利證書。不同來源造血干細(xì)胞的比較：

造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志造血干細(xì)胞的分離純化造血干細(xì)胞的檢測方法造血干細(xì)胞的可塑性

造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志

造血干細(xì)胞在細(xì)胞大小上類似于小淋巴細(xì)胞，細(xì)胞密度一般小于1.066g/ml。因此，至今仍不能單純從形態(tài)學(xué)上來識別造血干細(xì)胞。而要對造血干細(xì)胞進(jìn)行研究，首先必須能把它從造血組織中分離出來。最常用的方法就是利用造血干細(xì)胞表面的標(biāo)志蛋白對其進(jìn)行分離。

人的造血干細(xì)胞表面標(biāo)志包括CD34+、CD38－、Lin－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、CD45RA－、CD71－等。人類造血干細(xì)胞還對5-氟脲嘧啶和4-氫過氧環(huán)磷酰胺有抗性。

在干細(xì)胞不同的分化階段，有不同的表面標(biāo)志表達(dá)，故不同的表面標(biāo)志已成為區(qū)分造血干細(xì)胞分化階段的重要標(biāo)志。

祖細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD34+Lin+

，譜系特異性抗原包括粒系CD11、13、15、16；單核系CD14；B淋巴系CD19、20、21、22；T/NK系CD2、11、25、7、56；紅系CD47、59、71；巨核系CD31、41、42、61、63、107等。

CD34是人們普遍認(rèn)同的造血干／祖細(xì)胞的代表性表面標(biāo)志，隨細(xì)胞分化成熟逐漸減少甚至消失。CD34抗原分子量為105—120KD，為高度糖基化的I型跨膜糖蛋白。CD34+造血細(xì)胞是一組異質(zhì)性細(xì)胞群體，可進(jìn)一步分化為CD34+CD38+和CD34+CD38-兩個亞群。CD34+細(xì)胞群中90％為祖細(xì)胞，極少為造血干細(xì)胞。

雖然CD34+細(xì)胞不全是造血干細(xì)胞，但是造血干細(xì)胞應(yīng)全部表達(dá)CD34分子，所以通過篩選CD34+細(xì)胞至少可以使造血干細(xì)胞得到富集。隨著造血干細(xì)胞的分化成熟，CD34表達(dá)水平逐漸下降，成熟血細(xì)胞（Lin+）不表達(dá)CD34。而最近的一些研究顯示，CD34+Lin-造血細(xì)胞又起源于CD34-Lin-。CD34表面標(biāo)志從無到有，又從有到無，充分顯示了造血干/祖細(xì)胞產(chǎn)生、發(fā)育、分化和成熟的全過程。造血干細(xì)胞的分離純化

近年來，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志研究的發(fā)展豐富了干細(xì)胞分離純化的手段。根據(jù)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志，可通過免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞儀、分子雜交和PCR等多種細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段來檢測造血干細(xì)胞。正如上述所提及的，現(xiàn)大多仍然基于對CD34+細(xì)胞的富集來篩選造血干細(xì)胞。

通常先利用密度梯度離心等方法去除待分離物中的紅細(xì)胞和成熟粒細(xì)胞等成分，獲得單個核細(xì)胞，從而使CD34+細(xì)胞初步富集；然后利用CD34分子特異的抗體標(biāo)記單個核細(xì)胞，通過熒光激活細(xì)胞分選(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)、流式細(xì)胞儀分離、免疫吸附系統(tǒng)（包括淘洗技術(shù)、免疫吸附柱層析、免疫磁珠等）等方法將被標(biāo)記的CD34+細(xì)胞與未被標(biāo)記的CD34—細(xì)胞分離開來，即獲得純化的CD34+細(xì)胞。

其中，F(xiàn)ACS系統(tǒng)造血干細(xì)胞（CD34+）分選純度達(dá)到95%，但是，成本較高，儀器也較貴，而免疫磁珠分離系統(tǒng)分離量大，分離純度和細(xì)胞質(zhì)量也能夠滿足臨床要求，已經(jīng)被臨床工作者接受。

另外，也可以利用造血干細(xì)胞大多處于靜止期，對活體染料拒染的特性對其進(jìn)行富集純化。例如，采用RNA結(jié)合染料PyroninY、線粒體結(jié)合染料Rhodamine123或DNA結(jié)合染料Hochest33342均可用于造血干細(xì)胞的純化。新近，還有人根據(jù)造血干細(xì)胞移植后迅速向骨髓歸巢的特性，建立了一種體內(nèi)分離造血干細(xì)胞的方法，這是利用造血干細(xì)胞的功能特性來對其進(jìn)行分離的。造血干／祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

分離純化后的造血干／祖細(xì)胞培養(yǎng)方法有多種，可采用液體或半固體培養(yǎng)基，后者可用甲基纖維素或瓊脂作為支撐物，培養(yǎng)基中可含／不含血清。G0期干細(xì)胞對細(xì)胞因子的刺激不敏感，而進(jìn)人增殖周期的干／祖細(xì)胞卻依賴細(xì)胞因子，培養(yǎng)基中加人不同的細(xì)胞因子及組合可誘導(dǎo)造血干細(xì)胞向不同的方向分化。

此外，用原代胚胎成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞或一些相關(guān)的細(xì)胞系等作飼養(yǎng)層細(xì)胞，可為造血干／祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增和分化提供適宜的造血微環(huán)境，在造血細(xì)胞的分化、發(fā)育中起至關(guān)重要的作用。Hagihara等研究證實(shí)，用鼠基質(zhì)細(xì)胞HESS-5作飼養(yǎng)層，在有人重組細(xì)胞因子存在時，可有效擴(kuò)增造血干／祖細(xì)胞，特別是CD34+CD38-細(xì)胞，并有助于分化成DCs的原始骨髓干細(xì)胞快速而持久的產(chǎn)生。造血干細(xì)胞的檢測方法

確認(rèn)小鼠造血干細(xì)胞的唯一標(biāo)準(zhǔn)仍然是多年來一直沿用的長期體內(nèi)重建造血能力（Long-termrepopulation,LTR）檢測。即：將細(xì)胞移植給經(jīng)致死劑量照射的受者，如果能夠使受者恢復(fù)長期各系造血，并且移植第二受者仍可重建其造血系統(tǒng)，那么就證明植入的細(xì)胞中確實(shí)含有造血干細(xì)胞。小鼠脾集落實(shí)驗(yàn)

但是，由于異體移植存在免疫排斥的問題，多年來對人骨髓細(xì)胞造血活力的檢測一直依賴于體外實(shí)驗(yàn)。近年來，隨著動物模型的不斷發(fā)展，使研究人造血干細(xì)胞體內(nèi)重建造血活力成為可能。在這些動物模型中，最為可靠的是綿羊子宮內(nèi)胎羊移植系統(tǒng)。該系統(tǒng)是在胎羊免疫系統(tǒng)發(fā)育前于子宮內(nèi)將人的造血細(xì)胞移植給胚胎羊，在小羊出生后，通過追蹤其體內(nèi)人不同血細(xì)胞系的分布和比例來判斷移植的人造血干細(xì)胞是否具有長期重建多系造血的能力。

該系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是可操作性差，但可進(jìn)行長達(dá)數(shù)年的觀察，而且可以進(jìn)行二次移植研究。最近，研究者又對該系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)：給移植人造血細(xì)胞后形成的嵌合體羊施用人晚期作用細(xì)胞因子，如GM-CSF、IL-3等。應(yīng)用這些細(xì)胞因子后，嵌合體羊骨髓中人血細(xì)胞的比例由5%增加到15%。這可能是由于細(xì)胞因子刺激人特異的定向祖細(xì)胞增殖分化的緣故，因此通過這種方法有可能使定向祖細(xì)胞逐漸耗竭，而相反，真正的干細(xì)胞并不受這些細(xì)胞因子的影響。造血干細(xì)胞的可塑性

一種成體干細(xì)胞可以生成另一個組織的特化細(xì)胞的能力，即成體干細(xì)胞具有一定跨系、甚至跨胚層分化的特性，稱其為干細(xì)胞的可塑性，又被稱為成體干細(xì)胞的橫向分化。橫向分化的發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞研究中具有革命性意義。它打破了用于臨床治療的干細(xì)胞只能來源于胚胎或受精卵的限制，為干細(xì)胞治療疾病提供了新途徑。

造血干細(xì)胞的可塑性是指除可以分化為各系血細(xì)胞外，還可以分化為多種非造血組織的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及多種組織的上皮細(xì)胞等。目前對造血干細(xì)胞多向分化的機(jī)制仍不清楚，對這一機(jī)制的探討以及對造血干細(xì)胞定向分化的調(diào)控將大大擴(kuò)展其在臨床上的應(yīng)用。因?yàn)檫@不僅可以繞過用人的胚胎干細(xì)胞作為移植治療的細(xì)胞來源，而且可以減輕異基因移植帶來的免疫排斥問題。造血干細(xì)胞移植

造血干細(xì)胞是血液成分之一，是生成各種血細(xì)胞的最起始細(xì)胞，存在于骨髓、胚胎肝、外周血及臍帶血中。它既具有高度自我更新能力，又具有進(jìn)一步分化各系統(tǒng)祖細(xì)胞的能力。近代輸血就利用這兩種能力，對受血者用放射或大劑量化學(xué)藥物使其免疫系統(tǒng)受抑再輸入獻(xiàn)血者的造血干細(xì)胞，讓它在受血者骨髓內(nèi)"定居下來，分化增殖"，這即是造血干細(xì)胞移植。

自體造血干細(xì)胞的移植

造血干細(xì)胞移植包括:

骨髓移植（BMT）胎肝造血細(xì)胞移植外周血干細(xì)胞（PBSC）移植臍帶血造血細(xì)胞移植造血干細(xì)胞移植

BMT是臨床最常用的造血干細(xì)胞移植。臨床分為同基因BMT（SBMT）、異基因BMT（ALLO-BMT）及自身BMT（ABMT）三種類型。前兩種主要用于腫瘤性血液病，遺傳性血液病及某些代謝性疾病，而自身BMT多用于白血病和實(shí)體瘤患者。臍血可用于同基因或異基因移植，也可用于自身造血重建，凡符合BMT適應(yīng)癥的病均可用臍帶血移植代替。人胎肝造血細(xì)胞臨床應(yīng)用方式有兩種，一種為胎肝細(xì)胞輸注（FLCI），另一種是胎肝移植（FLT）。

綜合文獻(xiàn)報道，用胎肝細(xì)胞輸注的疾病有再障，白血病、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、范可尼貧血、急性粒細(xì)胞缺乏癥、重癥肝炎或失代償期的肝硬化、化療中的實(shí)體瘤，腎性貧血等。

胎肝移植治療的疾病有重癥聯(lián)合免疫缺陷病、白血病、再障、地中海貧血、晚期淋巴瘤、急性放射病等。胎肝細(xì)胞用于臨床由于取材方便，輸注安全，不發(fā)生嚴(yán)重的移植物抗宿主病，故顯示一定的前景。

外周血肝細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用報道有治療急性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病及惡性腫瘤。與骨髓、胚胎肝的造血干細(xì)胞移植相比，外周血肝細(xì)胞移植的優(yōu)點(diǎn)是造血及免疫功能重建早；放射線的敏感性低，受體內(nèi)植入率高；自身外周血?dú)埓婺[瘤細(xì)胞比骨髓少；采集方便、不需骨髓穿刺，易被接受。

由于移植免疫學(xué)的進(jìn)展，人類造血干細(xì)胞移植已進(jìn)入一個新的發(fā)展階段，它已成為細(xì)胞工程學(xué)中的一個重要組成部分。

繼1988年第一例應(yīng)用人類臍帶血移植治療貧血癥成功后，臍帶血因其免疫抗原性較弱的特點(diǎn)，被認(rèn)為是極具潛力的自骨髓來源和外周血來源后，第三種造血干細(xì)胞移植的來源。值得一提的是，輸入的造血干細(xì)胞的數(shù)量多少，是影響造血干細(xì)胞移植成功率的因素之一。臨床應(yīng)用表明輸入的量越大，成功移植率越高。成人輸用造血干細(xì)胞一般要求（1～4）×106/kg體重，而每份臍血的含量僅在1×107左右，因此目前一般只用于兒童。

有了造血干細(xì)胞移植的支持，臨床醫(yī)生就可以使用超大劑量的放療、化療，最大限度地清除患者體內(nèi)的癌細(xì)胞，然后植入造血干細(xì)胞重建被破壞的造血和免疫系統(tǒng)。隨著臨床和基礎(chǔ)研究的發(fā)展，為其他器官的移植奠定基礎(chǔ)，又是造血干細(xì)胞移植作為支持治療的另一個方面。異基因造血干細(xì)胞移植后，可在受者體內(nèi)誘導(dǎo)形成供者-受者嵌合體，使受者產(chǎn)生對供者特異的、終生的耐受。這樣，在進(jìn)行組織或器官移植，就可以降低免疫排斥發(fā)生的強(qiáng)度，從而提高移植物的存活率。

此外，通過對自體造血干細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾后，使其缺陷基因的功能得到補(bǔ)充，也可以用于再生障礙性貧血、β地中海貧血等骨髓造血功能衰竭和某些先天遺傳性疾病或代謝系統(tǒng)疾病的移植治療，而且繞過了免疫排斥的問題。通過基因修飾，還可以賦予干細(xì)胞及其子代細(xì)胞新的特性，如轉(zhuǎn)入多藥耐藥基因MDR可使其抵抗化療帶來的清髓效應(yīng)；導(dǎo)入某種基因使其可抵抗HIV的感染等。

隨著造血干細(xì)胞及其細(xì)胞工程的飛速發(fā)展，造血干細(xì)胞已不再是傳統(tǒng)意義上的CD34+CD38-細(xì)胞或更早發(fā)育的細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞或體內(nèi)其他組織來源的干細(xì)胞，如肌肉干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等也可能作為造血細(xì)胞工程的種子細(xì)胞。造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞聯(lián)合移植將有可能用于器官再生。

造血干細(xì)胞移植是現(xiàn)代生命科學(xué)的重大突破。造血干細(xì)胞移植可治療惡性血液病，部分惡性腫瘤，部分遺傳性疾病等75種致死性疾病。包括急性白血病、慢性白血病、骨髓增生異常綜合征、造血干細(xì)胞疾病、骨髓增殖性疾病、淋巴增殖性疾病、巨噬細(xì)胞疾病、遺傳性代謝性疾病、組織細(xì)胞疾病、遺傳性紅細(xì)胞疾病、遺傳性免疫系統(tǒng)疾病、遺傳性血小板疾病、漿細(xì)胞疾病、地中海貧血、非血液系統(tǒng)惡性腫瘤、急性放射病等。造血干細(xì)胞與細(xì)胞治療

細(xì)胞治療，即給患者輸注治療細(xì)胞，通過這些細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮功能以達(dá)到治病的目的，如抗腫瘤等。

目前，已建立了體外誘導(dǎo)擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞DC（體內(nèi)抗原提呈功能最強(qiáng)的APC）方法，可以從臍帶血或自體的外周血干細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增出大量的DC，進(jìn)一步使其裝載腫瘤特異性抗原后，誘導(dǎo)抗原特異性CTL殺傷腫瘤細(xì)胞。DC回輸療法已成功地試用于非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤晚期患者的治療。