分子生物學(xué)-第5章-分子生物研究法(上)

第五章分子生物學(xué)研究法（上）——DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù) 從20世紀(jì)中葉開始,分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展,主要原因之一是研究方法,特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。 基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等,是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子,構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合,使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分,只不過它強調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實上,這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力,是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。5.1重組DNA技術(shù)回顧5.2DNA基本操作技術(shù)5.3RNA基本操作技術(shù)5.4SNP的理論與應(yīng)用5.5基因克隆技術(shù)5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)三大成就:1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者,即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì),解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScellsmixedwithlivingRcellsLivingScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae5.1重組DNA技術(shù)回顧1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細(xì)菌實驗2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatsonConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway3.50年代末至60年代,相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼,充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達(dá)。JacobandMonod但是,如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術(shù),科學(xué)家就無法對這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。兩大技術(shù)保證:1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶,1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’HerbertBoyer,StanleyCohen1972年獲得第一個重組DNA分子HerbertBoyer重組DNA實驗中常見的主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實驗或用來進(jìn)行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團(tuán)到目前為止,科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段,再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開,以供下一步研究。1972-PaulBerg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組遠(yuǎn)不能滿足基因研究的需要。DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力,要想得到足夠量和足夠純度的DNA,必須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上）,并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。這就是基因克隆,或分子克隆。分子克隆的載體具備自主復(fù)制能力的DNA分子（vector）,如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。從此,大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn),大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后,能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年,Cohen等人又報道,經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies表明:

（1）像pSC101這樣的質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆的載體,從而把外源DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞；（2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實現(xiàn)其功能表達(dá)；（3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系,有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術(shù)學(xué),這門技術(shù),對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,以及克隆DNA片斷的操作方面,都有著十分廣泛的使用價值。重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件年份事

件

1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964

C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965

S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由"質(zhì)粒"DNA所決定。1966

M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。1978

首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983

獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984

斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986

GMO首次在環(huán)境中釋放。1988

J.D.Watson出任"人類基因組計劃"首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992

歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定。2001完成第一個人類基因組全序列測定。2004中國科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測定。2005中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完黑猩猩基因組全序列測定。限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名,用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名,用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)即反相重復(fù)結(jié)構(gòu),是DNA分子中以某一處為軸,其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對稱的序列。切口:平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口DNA連接酶:通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片斷連接成一個整體DNA分子。T4ˉDNA連接酶EcoRI連接酶T7ˉDNA連接酶目的基因的來源原核細(xì)胞真核細(xì)胞:cDNA或gDNA文庫人工合成及PCR擴增目的基因天然DNA（染色體DNA.病毒DNA(噬菌體DNA)、質(zhì)粒DNA.線粒體DNA和葉綠體DNA）重組實驗中的主要載體定義:為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子?？寺≥d體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物,便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點）,常具有多個單一酶切位點,稱為多克隆位點；分子量小,以容納較大的外源DNA。噬菌體載體:雙鏈DNA病毒，約50kb,兩端有一個12個核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌體黏粒、YAC.BAC：高容量載體個克隆載體所容納的外原DNA片段的大小質(zhì)粒:10kbλ噬菌體:23kb黏粒:45kbBAC:350kbYAC:1000kb

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化（transformation）:P151感受態(tài)細(xì)胞（Competentcells）:受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如:CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許有外源DNA的載體分子通過，處于這種狀態(tài)下的細(xì)胞稱~將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系,使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀轉(zhuǎn)導(dǎo)？轉(zhuǎn)染？常用的轉(zhuǎn)化方法:化學(xué)轉(zhuǎn)化（CaCl2）法電擊法化學(xué)轉(zhuǎn)化原理:在0℃冷凍處理時，處于CaCl2低滲溶液中的大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球形。DNA可吸附于其表面。在短暫的熱沖擊下，細(xì)胞吸收外源DNA，然后在豐富培養(yǎng)基內(nèi)復(fù)原并增殖，表達(dá)外源基因。電擊轉(zhuǎn)化:使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。菌液:生長對數(shù)期場強(最大轉(zhuǎn)化效率):12.5-15kV/cm溫度:0-4℃克隆的篩選:抗生素基因。常用的抗生素有:氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等-互補藍(lán)白斑篩選營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）-互補篩選

β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個氨基酸編碼序列的質(zhì)粒編碼β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細(xì)胞IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上篩選藍(lán)白斑藍(lán)白斑篩選LacZ,IPTG

X-galX+gal

（白色）（藍(lán)色）

LacZ（失活）,IPTG

X-galX-gal

（白色）（白色）

藍(lán)白斑Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機體基因組中,分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段和載體分別進(jìn)行酶切。4.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。5.從大量的細(xì)胞繁殖群體中,篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞,并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。3.將酶切片段與具有選擇記號的載體連接,形成重組DNA分子。5.1重組DNA技術(shù)回顧5.2DNA基本操作技術(shù)5.3RNA基本操作技術(shù)5.4SNP的理論與應(yīng)用5.5基因克隆技術(shù)5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5.2

DNA基本操作技術(shù)

5.2.1

核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如:DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。

一種分子被放置到電場中,它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度,叫做電泳的遷移率,它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說,電場強度越大,電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多,其遷移的速度越快,反之則較慢。由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì),如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等,故電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù),因此,根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡,便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來?；驹碓谏項l件下,核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán),是呈離子化狀態(tài)的,所以,DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions）,把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中,它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì),相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下,DNA分子的這種遷移速度,亦即電泳的遷移率,取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān),凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小,濃度越高,孔隙越小,其分辨能力就越強。反之,濃度降低,孔隙就增大,其分辨能力也就隨之減弱。在凝膠電泳中,加入適量溴化乙錠（ethidiumbromide,簡稱EtBr）染料對核酸分子進(jìn)行染色,然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察,可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位,即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA,也可以被清晰地檢測出來。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點樣電泳檢測結(jié)果將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起,其相應(yīng)的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機體,所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。5.2.2核酸的分子雜交

不同溫度下DNA的構(gòu)型變化一DNA/DNA的雜交作用,可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關(guān)系,而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

不同溫度下DNA的構(gòu)型變化二在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中,經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子,都必須通過毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上,而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的,因此,核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。SouthernBlottingE.M.Southern于1975年首先設(shè)計出來的。材料:尼龍濾膜硝酸纖維素濾膜二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）步驟:第一,將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上－核酸印跡轉(zhuǎn)移電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法第二,是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交雜交模式圖放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交－＋SouthernBlotting的過程1.提取DNA,酶解；2.瓊脂糖凝膠上電泳分離；3.轉(zhuǎn)?。ㄞD(zhuǎn)移）DNA4.固定膜上的DNA5.預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測）6.洗膜7.顯影檢測（放射性/酶促）Southernblot轉(zhuǎn)移裝置圖在理想條件下,應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù),即便每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。由于放射性同位素對人體的危害,近年來又發(fā)展了熒光法檢測雜交信號的技術(shù),雖然靈敏度略低于同位素法,卻使核酸雜交實驗變得更為安全。常用的熒光染料:C5.C3等NorthernHybridization

IsolatemRNA(DifferentLengths)ProbewithlabeledDNA是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上,進(jìn)行核酸雜交的一種實驗方法。類似于Southernblot,但用于檢測RNA的分子雜交技術(shù),用于分析總RNA或mRNA1）RNA提取2）RNA電泳（分離不同長度RNA)3）轉(zhuǎn)膜(形成固相RNA)4）探針標(biāo)記（同位素/非同位素）5）預(yù)雜交,雜交6）洗膜7）顯影（放射性/酶促）步驟YLNSESLSMKK9MPK1MPK3MPK618SrRNAMPK7Northern5.2.3

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制,它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發(fā)表了第一個單純且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個周期反應(yīng)）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于1983年由Dr.KaryB.Mullis提出,并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后,PCR技術(shù)在生物科學(xué)研究和應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用,成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。1.變性（90℃-96℃）在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,形成單鏈DNA,稱之為變性。2.退火（25℃-65℃）是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補的一小段DNA片段。3.延伸（70℃-75℃）從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點,將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步:PCR反應(yīng)體系引物dNTPMg2+Taq聚合酶模板反應(yīng)緩沖液引物設(shè)計的基本原則:1.引物的長度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38bp,因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。2.引物序列3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基,如GGG或CCC,也會使錯誤引發(fā)機率增加。3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基,因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外,兩條引物3’端若互補,或者單條引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。4.5’端序列對PCR影響不太大,因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物?？稍谝镌O(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等.通常應(yīng)在5‘端限制酶位點外再加1-2個保護(hù)堿基。5.引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng),因為GC含量決定了DNA雙鏈的解鏈溫度（Tm）。另外,上下游引物的GC含量不能相差太大。6.一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體,過低則降低產(chǎn)量。用NaOH

將pH調(diào)至7.0。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4種dNTP各20μmol/L,足以在100μl反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。

dNTPPCR反應(yīng)體系-Mg2+Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,Mg2+濃度過低,會顯著降低酶活性;Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。Mg2+濃度還影響引物退火和解鏈溫度以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L,1.5mM最佳。PCR反應(yīng)體系-Taq聚合酶擴增效率最高,1000bp/min

活性

5’-3’DNA聚合酶活性強

無3’-5’DNA外切酶活性,錯配率每個循環(huán)約1/6000

3’末端加“A”,產(chǎn)物可直接進(jìn)行“TA”克隆pfu酶——保真度高原理:具3’－5’核酸外切酶活性,即校正功能。

效率相對較低,500bp/min3’末端不加“A”,加A后才可進(jìn)行TA克隆。就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中的模板濃度為50-100ng/ml。模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率.PCR反應(yīng)體系-模板DNAPCR反應(yīng)體系—PCR反應(yīng)緩沖液緩沖液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8),50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+.另外,反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性。PCR反應(yīng)參數(shù):變性在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性3-5min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全,往往使PCR失敗,因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量。對于富含GC的序列,可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。

PCR反應(yīng)參數(shù):退火引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成、引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃,時間一般為20-60s。PCR反應(yīng)參數(shù):延伸延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃。實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃。一般在擴增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(5-10min)的延伸反應(yīng)。以獲得盡可能完整的產(chǎn)物,這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。PCR反應(yīng)參數(shù):循環(huán)次數(shù)當(dāng)其它參數(shù)確定之后,循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。如果此時產(chǎn)物量仍不夠,需要進(jìn)一步擴增,可將擴增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板,重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴增,這樣經(jīng)60輪循環(huán)后,擴增水平可達(dá)109-1010。PCR反應(yīng)程序:溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（0.5min）60℃退火（0.5min）72℃延伸（1min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)394℃預(yù)變性（5min）PCR技術(shù)在基因克隆方面的應(yīng)用

（1）目的基因的直接克隆,（2）通過RT-PCR進(jìn)行cDNA的克隆；（3）制備DNA探針,進(jìn)行分子檢測等。5.2.4.實時定量PCR一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。實時熒光定量pcr技術(shù)中的一些重要因素:Ct值。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?？衫脕碛嬎愠鲈摌悠返钠鹗伎截悢?shù)。實時熒光定量PCR中熒光化學(xué)，熒光定量pcr所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下:TaqMan熒光探針:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。SYBR熒光染料:在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。TaqMan熒光探針SYBR熒光染料5.2.5.基因組DNA文庫的構(gòu)建從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA將其切成預(yù)期大小的片段,分別與載體連接,轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞,形成克隆。這樣每一個細(xì)胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子,而且可以繁殖擴增,許多細(xì)胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體,就稱為基因組DNA文庫。如果這個文庫足夠大,能包含該生物基因組DNA全部的序列,就是該生物完整的基因組文庫。基因組DNA文庫可用于分離特定的基因片斷、分析特定基因結(jié)構(gòu)、研究基因表達(dá)調(diào)控、還可用于全基因組物理圖譜的構(gòu)建和全基因組序列測定。基因組DNA文庫的構(gòu)建過程5.1重組DNA技術(shù)回顧5.2DNA基本操作技術(shù)5.3RNA基本操作技術(shù)5.4SNP的理論與應(yīng)用5.5基因克隆技術(shù)5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5.3RNA基本操作技術(shù)5.3.1總RNA的提取RNA易遭降解，實驗要求較嚴(yán)格?？俁NA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。異硫氰酸胍法（TriZol）原理:TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。5.3.2mRNA的純化mRNA的分離方法較多,其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效,已成為常規(guī)方法。利用mRNA的PolyA結(jié)構(gòu),試劑盒提供一種生物素化寡聚dT引物,與PolyA雜交,形成生物素化寡聚dT-mRNA的雜交體,然后利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合作用以鏈抗生物素-順磁顆粒（SA-PMPs）結(jié)合雜交體,形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs復(fù)合物,再利用磁性吸附作用以磁性條吸附復(fù)合物中的SA-PMPs顆粒,最后利用高嚴(yán)緊度鹽溶液中分子雜交體磁性減弱,雜交體中生物素化寡聚dT引物與mRNA分離,從而純化得到mRNA。PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖5.3.3cDNA的合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,有反轉(zhuǎn)錄酶催化,該酶合成DNA時需要引物引導(dǎo),常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板,由DNA聚合酶催化。5.3.4cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的cDNA加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。步驟:提取總RNA，在獲得高質(zhì)量的mRNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成接頭的加入、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析cDNA插入片斷，擴增cDNA文庫、對建立的cDNA文庫進(jìn)行鑒定。這里強調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是λ噬菌體，這是因為λDNA兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA。RNA分離富集5.3.5基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有:核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法5.1重組DNA技術(shù)回顧5.2DNA基本操作技術(shù)5.3RNA基本操作技術(shù)5.4SNP的理論與應(yīng)用5.5基因克隆技術(shù)5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5.1重組DNA技術(shù)回顧5.2DNA基本操作技術(shù)5.3RNA基本操作技術(shù)5.4SNP的理論與應(yīng)用5.5基因克隆技術(shù)5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在多細(xì)胞的高等生物個體水平上,人們用克?。╟lone）表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細(xì)胞水平上,克隆一詞是指由同一個祖細(xì)胞（progenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。在分子生物學(xué)上,人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中,使之得以永久保存和復(fù)制這種過程稱為克隆。5.5基因克隆技術(shù)分子克隆的主要方法（1）構(gòu)建cDNA.核DNA文庫，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因；

（2）差式雜交(differentialscreen)和扣除雜交(subtractivehybridization)技術(shù)；

（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術(shù)；

（4）差別分析法(RDA法，即Representationaldifferenceanalysis）；

（5）酵母雙雜交體系Two-hybridsystem；

（6）圖位克隆法（map-basedcloning）與染色體步移（genomicDNAWalking）。

5.5.1RACE技術(shù)RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）是用于從已知cDNA片段擴增全長基因的方法,它根據(jù)已知序列設(shè)計基因片段內(nèi)部特異引物,由該片段向外側(cè)進(jìn)行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE,用于擴增3’端的稱為3’RACE。已知cDNA序列可來自序列表達(dá)標(biāo)簽、減法cDNA庫、差法顯示和基因文庫篩選。5’RACE在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以已知基因片段內(nèi)部。特異性引物啟始cDNA第一條鏈的合成RNase混合物降解模板mRNA,純化cDNA第一條鏈。用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3‘端加入連續(xù)的dCTP以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進(jìn)行PCR擴增,以期得到目的片段,并可用nestPCR進(jìn)行檢測。3’RACE是在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以連有可以和polyA配對的oligo(dT)的錨定引物啟始cDNA第一條鏈的合成。用RNaseH降解模板mRNA。用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進(jìn)行PCR擴增得到目的3‘片段,并可用nestPCR的方法繼續(xù)進(jìn)行檢測和擴增。5.5.2應(yīng)用cDNA差示法分析克隆基因cDNA差示分析法（representationaldifferenceanalysis,RAD）充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板,僅以線形形式擴增單鏈模板的特性,通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法,特異性擴增目的基因片斷。5.5.3Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)Gateway克隆技術(shù)是利用λ噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發(fā)生的位點特異性的重組整合與切出反應(yīng)。整合反應(yīng)是由Int（integrase）和IHF（IntegrationHostFactor）催化的。attB和attP之間的重組整合的噬菌體基因組DNA的5’和3’端含有attL和attR位點。切出的