脫毒技術(shù)及組織培養(yǎng)操作

菊花的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)項(xiàng)目八教學(xué)終極目標(biāo)能選取菊花外植體進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)與快速繁殖能解決菊花組培快繁中出現(xiàn)的基本問(wèn)題。

熟悉菊花的組培脫毒方法和流程。熟悉常用脫毒苗檢測(cè)方法。促成目標(biāo)教學(xué)目標(biāo)菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物,是我國(guó)的傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一長(zhǎng)期以來(lái)菊花采用分株、扦插等無(wú)性繁殖方法進(jìn)行繁殖但是傳統(tǒng)的繁殖方法易受環(huán)境影響,繁殖周期長(zhǎng),隨著市場(chǎng)需求的急劇增加,已經(jīng)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)日益發(fā)展的需要。植物組織培養(yǎng)具有增殖效率高、繁殖速度快的特點(diǎn),可以用較短的時(shí)間和較少的空間生產(chǎn)出大量的試管苗項(xiàng)目介紹矮縮類(lèi)病毒褪綠斑駁病毒B病毒菊花番茄不孕病毒病毒種類(lèi)工作任務(wù)

通過(guò)菊花的莖尖培養(yǎng)獲得無(wú)病植株任務(wù)1通過(guò)愈傷組織途徑或叢芽途徑獲得菊花試管苗任務(wù)2菊花試管苗生根培養(yǎng)

任務(wù)3實(shí)踐操作一、菊花的莖尖組織培養(yǎng)脫毒（一）材料選擇和消毒（二）脫毒苗培養(yǎng)（三）脫毒鑒定（四）移栽二、菊花的組培快繁（一）外植體材料選擇與滅菌（二）誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)（三）生根、移栽莖尖培養(yǎng)脫毒菊花脫毒苗外植體愈傷組織誘芽生根叢生芽成苗脫毒苗鑒定菊花脫毒流程圖（一）材料選擇和消毒

在溫室中選取生長(zhǎng)健壯的菊花，剪下其莖尖段，放入無(wú)菌容器內(nèi)封口。用清水反復(fù)沖洗4～5次，將洗凈的材料放到75%的酒精溶液中浸泡30s。然后用蒸餾水洗凈，再將材料放入10%的漂白粉濾液消毒8min，再用無(wú)菌水沖洗3～5次，濾紙吸干。再將材料轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液消毒，不低于5min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次，濾紙吸干。最后將材料放入無(wú)菌的三角瓶中封口待用。菊花的莖尖組織培養(yǎng)脫毒（二）脫毒苗培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上將滅過(guò)菌的材料放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用解剖針剝?nèi)タ梢?jiàn)的生長(zhǎng)點(diǎn)，周?chē)梢?jiàn)的小葉在解剖鏡下只剩下1～2個(gè)葉原基，取下只有0.2～0.3mm生長(zhǎng)點(diǎn)，放入提前做好的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

然后將裝有材料的培養(yǎng)基放入光照箱中進(jìn)行培養(yǎng)。要求在黑暗或散射光下培養(yǎng)，溫度28℃。待培養(yǎng)外植體出現(xiàn)愈傷組織后更換培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行繼代培養(yǎng)。并在光照燈下補(bǔ)充光照，光照強(qiáng)度1000～4000Lx，溫度23～25℃。待出芽后將其轉(zhuǎn)入到另外的生根培養(yǎng)基中促使生根。（三）脫毒鑒定

采用病毒的汁液感染法，由受檢植株上取下葉片，置于等容積(W/V)的緩沖液(0.1mol/L磷酸鈉)中，用研缽體和研桿將葉片研碎。在指示植物(一般采用萬(wàn)壽菊)的葉片上滴上此溶液，觀察1周后得到結(jié)果。并統(tǒng)計(jì)脫毒率。待測(cè)（四）移栽

幼苗移栽前先煉苗2～3d，即移栽前先把培養(yǎng)基瓶的塞子打開(kāi)，放在25℃左右的溫室中，增加組培苗對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力。移栽時(shí)仔細(xì)洗去附著在幼苗上的培養(yǎng)基，然后移植于適宜的基質(zhì)中，澆足定根水，蓋上薄膜保持溫度，避免陽(yáng)光直射，并注意通風(fēng)換氣，溫度控制在18～20℃。1～2周后揭掉薄膜，每隔3～5d葉面噴施營(yíng)養(yǎng)液，1個(gè)月即可上盆或定植于田間。菊花的組培快繁（一）外植體材料選擇與滅菌

選取在脫毒實(shí)驗(yàn)中成功移栽上盆而且長(zhǎng)勢(shì)健壯的植株作為外植體母株，以培養(yǎng)出大量的無(wú)病植株。在外植體的選擇上，可以選取生長(zhǎng)健壯嫩莖和葉片作為材料。流水洗去表面灰塵，在超凈工作臺(tái)用75%酒精處理20～30s，再用無(wú)菌水沖洗3～5次，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液浸泡7～10min，再用無(wú)菌水沖洗4～6次，用濾紙吸干水分。（二）誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，用剪刀將外植體莖段切成0.5～1cm長(zhǎng)小段，水平放置接種；葉片切成5mm×5mm小塊，下表皮朝下水平放置接入初代培養(yǎng)基中，接種完成后即轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室進(jìn)行初代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22～28℃，光強(qiáng)1000～4000Lx。1.間接再生途徑

莖段和葉片接種到培養(yǎng)基上，均可以從一周內(nèi)，明顯可以看到莖段和葉片開(kāi)始膨大。20d后產(chǎn)生愈傷組織，30d愈傷組織分化出芽。2.直接再生途徑

莖段和葉片接種到培養(yǎng)基上，均可以從一周內(nèi)，明顯可以看到莖段和葉片開(kāi)始膨大。但是20d后不產(chǎn)生愈傷組織，直接分化出芽。菊花再生植株（三）生根、移栽

當(dāng)培養(yǎng)基中的植株出芽后，再將其轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其生根?；蛲ㄟ^(guò)無(wú)根嫩莖扦插生根。1.試管生根切取3cm左右無(wú)根嫩莖，轉(zhuǎn)插到1/2MS+NAA0.1培養(yǎng)基中，經(jīng)兩周即可生根，然后移栽馴化。移栽初期保持高濕度條件，營(yíng)養(yǎng)缽基質(zhì)澆透水，取出生根的試管苗，洗掉附加在根部的培養(yǎng)基，用竹簽在基質(zhì)上打一小孔，將幼苗插入基質(zhì)中。然后家設(shè)小拱棚以保濕，隨著幼苗的生長(zhǎng)，逐漸降低空氣濕度和基質(zhì)含水量，轉(zhuǎn)為正常的管理階段。2.扦插生根

利用菊花無(wú)根嫩莖易于生根的特點(diǎn)，也可免去試管生根這道程序。剪取2～3cm無(wú)根苗，插植到珍珠巖或蛭石的基質(zhì)中，基質(zhì)事先用生根激素溶液浸透，10d后生根率可達(dá)95%～100%。菊花煉苗菊花移栽苗如何檢測(cè)脫毒苗脫毒率（效果）？一、直接檢測(cè)法

看植株的莖葉是否有該病毒所有的可見(jiàn)癥狀侵染后的病株表現(xiàn)為局部或系統(tǒng)花葉、皺縮、卷葉、黃化，老葉上出現(xiàn)紫色邊緣的褪綠斑，也有沿葉脈形成紫色羽狀班駁的，在春秋季比較明顯。病株較脫毒苗生長(zhǎng)勢(shì)減弱，有矮化或畸形等癥狀。問(wèn)題探究一草莓無(wú)病毒苗草莓有病毒苗（二）生物鑒定法1.敏感（指示）植物的概念

有些植物對(duì)病毒極為敏感，一旦感染病毒就會(huì)在其葉片乃至全株上表現(xiàn)特殊的病斑，這種植物稱(chēng)為敏感植物或指示植物。每種病毒都有自己的敏感植物，如馬鈴薯病毒的敏感植物有千日紅、黃花煙、新葉煙，毛葉曼佗羅；草莓病毒的敏感植物有野草莓、野紅草莓；香石竹病毒的指示植物昆落阿藜、莧色藜；菊花病毒的敏感植物有矮牽牛、缸豆。2.鑒定方法（1）摩擦接種鑒定法取待檢測(cè)植物的汁液摩擦接種在各自的敏感植物上，然后視其有無(wú)病斑，來(lái)判斷是否脫除了病毒。（2）嫁接鑒定法有些病毒不是通過(guò)汁液傳播，而是通過(guò)專(zhuān)門(mén)介體如蚜蟲(chóng)傳播，放蚜蟲(chóng)咬待測(cè)植株，再將蚜蟲(chóng)接種到敏感植物上，一段時(shí)間后觀察敏感植物癥狀，根據(jù)敏感植物的病癥表現(xiàn)來(lái)判斷是否脫除了病毒。優(yōu)點(diǎn)：條件簡(jiǎn)單，操作方便。缺點(diǎn)：只能測(cè)出病毒的相對(duì)感染力，并且只能用來(lái)鑒定靠汁液及嫁接傳染的病毒。（三）抗血清鑒定法

當(dāng)動(dòng)物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生特異的免疫球蛋白，其被稱(chēng)為“抗體”，而引起形成抗體的物質(zhì)（病毒或異體蛋白）稱(chēng)為“抗原”。

抗體在特殊的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，進(jìn)入血液存在于血清和體液內(nèi)?？乖涂贵w結(jié)合的反應(yīng)稱(chēng)為“血清反應(yīng)”，抗原和抗體結(jié)合表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性，即一種病毒產(chǎn)生的抗體只能結(jié)合該種病毒，因此用已知病毒的抗血清可以用來(lái)鑒定未知病毒的種類(lèi)。這種方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，是近年來(lái)抗血清鑒定方法中發(fā)展最迅速，應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法是一種普遍采用的抗血清鑒定方法，該方法將抗原固定在酶標(biāo)記板上，加入待測(cè)血清，然后在加入酶標(biāo)記的抗體（酶通常是一種過(guò)氧化酶或磷酸酶），使與待測(cè)血清中已與抗原結(jié)合的特異性抗體結(jié)合，最后用分光光度計(jì)做出判斷。酶聯(lián)免疫吸附法是一種非常敏感的方法，能檢測(cè)出10-5數(shù)量級(jí)的病毒濃度。

（四）分光光度法要定量測(cè)定病毒，可以采用分光光度法。即把病毒的純品干燥、稱(chēng)重，配成已知濃度的病毒懸浮液，在260nm下測(cè)其光密度，并折算成消光系數(shù)（E10.1%cm）。一般常見(jiàn)病毒的消光系數(shù)都可以從文獻(xiàn)中查出來(lái)。利用分光光度法測(cè)得的病毒濃度是指全部核蛋白的濃度。（五）電子顯微鏡鑒定法

用電鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有病毒粒子存在，還可以測(cè)量病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)。電鏡鑒定法是一種即準(zhǔn)確又科學(xué)的鑒定方法。

人的眼睛難以觀察小于0.1mm的微粒；普通光學(xué)顯微鏡只能看到小至200bm的微粒；電子顯微鏡能分辨0.5μm大小的病毒顆粒。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高。是一種較為先進(jìn)的方法缺點(diǎn)：需一定的設(shè)備和技術(shù)HIVSARS問(wèn)題探究二

如何建立植物再生體系？建立再生體系，有直接和間接再生途徑。先在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，再使外植體經(jīng)過(guò)脫分化和再分化誘導(dǎo)芽，這稱(chēng)為間接再生途徑。

特點(diǎn)：操作繁瑣、成本較高。通過(guò)最初的愈傷組織階段進(jìn)一步誘導(dǎo)芽可能會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)繁殖變異和嵌合體的產(chǎn)生，而直接再生不定芽，稱(chēng)為直接再生途徑。特點(diǎn)：直接再生途徑不需要設(shè)置專(zhuān)門(mén)誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基，直接誘導(dǎo)出芽，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)程序，節(jié)省了時(shí)間和組培費(fèi)用。知識(shí)拓展菊花花瓣組織培養(yǎng)技術(shù)

（一）外植體的選擇和消毒

將菊花的花瓣用自來(lái)水沖洗20min,用70%的酒精浸泡30s,再用0.1%的升汞分別消毒10min,無(wú)菌水沖洗4～5次,用無(wú)菌濾紙吸干水分。（二）初代培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下將花瓣切成5mm×5mm小塊,接種到MS+6-BA1.5+NAA0.1的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,光照強(qiáng)度2000Lx,光照時(shí)間為12h/d,空氣相對(duì)濕度為65%左右。培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。培養(yǎng)25d后出現(xiàn)黃綠色的愈傷組織塊，誘導(dǎo)率高。（三）分化、繼代培養(yǎng)

將上步得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接在誘導(dǎo)叢生芽的分化培養(yǎng)基MS+6-BA2.0+NAA0.1上，培養(yǎng)1周左右,觀察到愈傷組織表面陸續(xù)長(zhǎng)出不定芽，繼續(xù)增殖培養(yǎng)達(dá)到所需芽叢數(shù)。（四）生根培養(yǎng)（略）課后作業(yè)1.植物組培快繁基本流程是什么？2.菊花組培成苗的形式有幾種？有何區(qū)別？3.結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際，設(shè)計(jì)一種菊花組培快繁方案。謝謝!蔬菜與農(nóng)作物的組織培養(yǎng)

一、結(jié)球甘藍(lán)的組織培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)(Brassica

oleracea．Var.capitata.)為十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中的一個(gè)變種、是全國(guó)各地均有栽培的大宗蔬菜作物之一，以產(chǎn)量高，抗病性強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)豐富，品質(zhì)優(yōu)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用而贏得生產(chǎn)者和消費(fèi)者的喜愛(ài)。但隨著保護(hù)地栽培的發(fā)展和甘藍(lán)反季節(jié)生產(chǎn)與銷(xiāo)售的需要，生產(chǎn)上急需品質(zhì)更優(yōu)、抗病性和適應(yīng)性更強(qiáng)、產(chǎn)量更高的新品種，僅靠常規(guī)育種方法很難取得突破性進(jìn)展。采用組織培養(yǎng)技術(shù)與常規(guī)方法相結(jié)合，就可以解決常規(guī)育種不能解決的問(wèn)題。另外，甘藍(lán)組織培養(yǎng)還可以進(jìn)行快繁良種種苗、臨時(shí)保存雄性不育材料和固定雜種優(yōu)勢(shì)等，表現(xiàn)出明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景?？捎糜诟仕{(lán)離體快繁的外植體很多，有根、花莖、葉、莖尖、幼苗的子葉和下胚軸等。

1．外植體選擇與處理將甘藍(lán)葉球剝?nèi)ト~片，留下中心柱和腋芽，洗凈泥土，用自來(lái)水沖洗15～20min，用70％的酒精浸泡1～2min，再用0．2％的升汞浸泡l0～15min，然后用無(wú)菌水沖洗3次。也可以用幼苗的頂芽作外植體，消毒方法同腋芽。

2．初代培養(yǎng)在解剖鏡下剝離頂芽或腋芽，接種在培養(yǎng)基MS十IAA0.2～0.5mg/L+6－BA1.0～3.0mg/L上，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光強(qiáng)1000～30001x，光照12～13h/d，溫度(20土2)℃，空氣相對(duì)濕度50％～60％，自然通風(fēng)。一般接種2～3d后芽尖轉(zhuǎn)綠，15d左右分化新芽，30～50d后形成叢生芽。

3．增殖培養(yǎng)將初代誘導(dǎo)出的叢生芽切分成單芽，轉(zhuǎn)入上述培養(yǎng)基培養(yǎng)，反復(fù)繼代增殖，直到達(dá)到繁殖數(shù)量為止。

4．誘導(dǎo)生根及馴化移栽誘導(dǎo)新梢生根時(shí)，基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，其中附加低量的NAA或不附加任何激素。為促進(jìn)幼根原基的發(fā)育和新生根的生長(zhǎng)，有時(shí)可在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭。培養(yǎng)溫度一般為(25±2)℃，光照時(shí)間為12～16h/d。當(dāng)根長(zhǎng)l～2cm、具3～4片葉時(shí)，將甘藍(lán)組培苗按常規(guī)要求煉苗后,即可移栽于富含腐殖質(zhì)土的營(yíng)養(yǎng)缽中，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出新葉片時(shí)即可移栽于大田。二、無(wú)籽西瓜的組織培養(yǎng)無(wú)籽西瓜是四倍體與二倍體西瓜雜交而成的三倍體西瓜，含糖量高，品質(zhì)好，商品價(jià)值高。但由于三倍體西瓜制種過(guò)程復(fù)雜，存在采種量低、種子發(fā)芽率和成苗率低的“三低”現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了無(wú)籽西瓜的發(fā)展。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)優(yōu)良三倍體西瓜進(jìn)行無(wú)性繁殖和保存，可以大大簡(jiǎn)化制種程序，降低生產(chǎn)成本。組培快繁技術(shù)

1．無(wú)菌苗培養(yǎng)

(1)西瓜籽消毒取無(wú)籽西瓜的種子用水浸泡24h，70％酒精消毒1～2min，再轉(zhuǎn)入0.1％升汞溶液中消毒15～20min，無(wú)菌水沖洗4～5次，在無(wú)菌條件下剝?nèi)シN殼，置于無(wú)激素的1/2MS培養(yǎng)基中，直接接受光照或發(fā)芽后再行光照培養(yǎng)，30～33℃下發(fā)芽。

(2)小腋芽消毒用于西瓜蔓的消毒劑為滴加少量吐溫-80的4.0％漂白粉溶液。先將西瓜蔓在清水中漂洗、揩干，再用70％酒精擦凈。然后置于上述消毒劑中消毒15～30min，在無(wú)菌水中漂洗5次，接種于1/2MS的培養(yǎng)基中或直接放于增殖培養(yǎng)基中，在25～28℃的條件下培養(yǎng)。

2．芽或不定芽的增殖待種子長(zhǎng)出胚根和子葉后，切取長(zhǎng)約1cm的頂芽接種到附加激素的MS培養(yǎng)基(pH值為6．4)上，在光照12h/d、光強(qiáng)2000～30001x的條件下培養(yǎng)。大約20d后頂芽及其周?chē)囊秆吭鲋承纬裳繀?。芽叢可以再分割轉(zhuǎn)接增殖，3～4周后頂芽或腋芽又可形成新的芽叢。側(cè)芽增殖的數(shù)量與激素的種類(lèi)和濃度有關(guān)。附加BA0.25～0.5mg/L,培養(yǎng)3～4周可形成具5～10個(gè)芽的芽叢，若芽的數(shù)量再高則易形成葉叢，莖不伸長(zhǎng)；附加2ip1.0mg/L，能形成3～8個(gè)芽的芽叢，產(chǎn)生芽的數(shù)量過(guò)高、過(guò)低都影響芽的分化；附加KT2.0mg/L，只能形成2～3個(gè)芽的芽叢，若再降低數(shù)量則不能形成叢生芽，而提高產(chǎn)生芽的數(shù)量，則培養(yǎng)效果并不比低濃度的BA好。IAA與BA配合使用有助于芽的生長(zhǎng)和增殖，當(dāng)加入BA0.25～0.5mg/L和IAA1.0mg/L時(shí)，芽的分化數(shù)量多，發(fā)育正常且穩(wěn)定。

3．試管苗嫁接與移栽無(wú)籽西瓜試管苗生根效果差，移栽成活率不高。因此，目前多采用試管苗嫁接的方法，即用試管苗做接穗，嫁接在實(shí)生砧木苗上。粗壯的接穗(節(jié)間密，粗度為3mm，長(zhǎng)2cm以上)用劈接法，細(xì)接穗(節(jié)間長(zhǎng)度在2cm以上、粗度為2mm)則用插接法。影響嫁接成活的主要因素是接穗的質(zhì)量。一般長(zhǎng)度在2cm以上的健壯芽苗做接穗成活率高，不足1cm長(zhǎng)的細(xì)嫩芽苗，嫁接不易成活。另外，當(dāng)砧木子葉平展、第1葉可見(jiàn)時(shí)為嫁接最適時(shí)期。長(zhǎng)期高溫培養(yǎng)的高腳苗不適于做砧木。嫁接后必須保持高溫、高濕環(huán)境(相對(duì)溫度95％以上，28～30℃)。嫁接成活后，當(dāng)植株長(zhǎng)出5～8片真葉時(shí)，即可移到室外煉苗，7d后定植于田間。馬鈴薯的組織培養(yǎng)馬鈴薯(Solanurn

tuberosurn)為茄科茄屬作物，是全球性重要的糧菜兼用作物。由于馬鈴薯具有生長(zhǎng)期短、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富、耐貯運(yùn)的特點(diǎn)，因此深受生產(chǎn)和消費(fèi)者的喜愛(ài)。但在馬鈴薯生產(chǎn)中普遍存在種性退化的問(wèn)題，而病毒侵染是馬鈴薯退化的根源。由于馬鈴薯是無(wú)性繁殖作物，所以病毒侵染后會(huì)世代相傳，危害逐年加重。目前，世界上公認(rèn)的解決馬鈴薯病毒危害，防止品種退化的有效途徑是莖尖離體培養(yǎng)。

1．脫毒方法(1)外植體選擇及處理外植體的選擇途徑一般有3條：①在生長(zhǎng)季節(jié)從田間挖取植株種植在無(wú)菌的盆土中，溫室內(nèi)栽培，取其新長(zhǎng)成枝條的芽；⑦從田間切取枝條，插入營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)，取新抽生枝條上的芽；③塊莖在室內(nèi)發(fā)芽，芽經(jīng)熱處理(38℃)2周后再取芽。另外，定期結(jié)植株噴施內(nèi)吸殺菌劑，如0.1％多菌靈和0.1％鏈霉素的混合液，可以有效提高滅菌效果。經(jīng)過(guò)上述須處理之后，要比直接取自田間枝條污染少得多。再加上莖尖分生組織又被彼此重疊的葉原基保護(hù)，只要仔細(xì)剝?nèi)?，無(wú)須再進(jìn)行消毒，就能得到無(wú)菌的外植體。但為保險(xiǎn)起見(jiàn)，在切取外植體之前，可以先進(jìn)行簡(jiǎn)單的表面消毒，一般在5％次氯酸鈉中處理8～10min即可。雖然頂芽和腋芽都能作為外植體，但頂芽的莖尖生長(zhǎng)要比腋芽的快，成活率也高，所以一般取頂芽作為外植體。

(2)剝離莖尖和接種在超凈臺(tái)上的解剖鏡(8～40×)下進(jìn)行莖尖剝離。解剖時(shí)必須注意使莖尖暴露的時(shí)間越短越好，以免超凈臺(tái)的氣流風(fēng)干莖尖。在材料下墊上一塊濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙也可達(dá)到保持莖尖新鮮的目的。在解剖鏡下用解剖針將葉片和葉原基剝掉，直到露出圓亮的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。將帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖切下，接種到培養(yǎng)基上。要注意防止交叉污染，尤其是當(dāng)芽未曾進(jìn)行過(guò)表面滅菌時(shí)更要謹(jǐn)慎。

(3)培養(yǎng)對(duì)馬鈴薯莖尖培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，MS和White基本培養(yǎng)基都是較好的培養(yǎng)基，而且附加少量(0.1～0.5mg/L)的NAA或BA或二者都加，培養(yǎng)效果更好。只有生長(zhǎng)點(diǎn)的極小莖尖的培養(yǎng)最好采用液體培養(yǎng)，多放在濾紙橋上培養(yǎng)。脫毒苗快繁技術(shù)

1．繼代培殖與生根培養(yǎng)將經(jīng)鑒定無(wú)毒的馬鈴薯脫毒苗，采用固體與液體培養(yǎng)基相結(jié)合的方法進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)效果好。取試管苗單節(jié)切段扦插在MS固體培養(yǎng)基上，每瓶可插20個(gè)左右莖段，經(jīng)20d左右便可發(fā)育成5～10cm高的小植株，然后進(jìn)行切段繁殖。此法速度快，每月可繁殖5～8倍。如果多莖節(jié)的試管苗接種在液體培養(yǎng)基上，進(jìn)行淺層靜止液體培養(yǎng)，則比固體培養(yǎng)基生根快，長(zhǎng)的粗壯，便于栽植，同時(shí)省去大量瓊脂，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)提高了試管苗成活率。培養(yǎng)基可選用MS培養(yǎng)基中的煙酸、肌醇都可以減去，瓊脂濃度也可降低。在25～28℃、光強(qiáng)3000～4000lx、連續(xù)光照的條件下，切段繁殖速度很快，一般每月能增加7～8倍。另外，也可將1～2cm高的苗轉(zhuǎn)入MS十IAA0.1～0.5mg/L十0.1～0.2g/L活性炭的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7～10d生根。

2．馴化移栽為增強(qiáng)試管苗對(duì)溫室內(nèi)環(huán)境條件的適應(yīng)能力，移植前對(duì)試管苗要進(jìn)行光、溫鍛煉。具體方法是：移植前7d左右，將長(zhǎng)有3～5片葉、高2～3cm的試管苗瓶擺放在溫室內(nèi)的馴化畦內(nèi)，畦內(nèi)澆上水，畦上方半遮陽(yáng)進(jìn)行馴化，以防止強(qiáng)光、高溫灼傷試管苗和維持試管苗周?chē)臏囟?。移至溫室的試管苗，盡管仍處于封口的瓶?jī)?nèi)，但由于封口膜透氣性好，瓶?jī)?nèi)的濕度下降，使試管苗的莖葉變硬，加上光照增強(qiáng)，莖稈變粗，葉片肥厚濃綠，有效地抑制了徒長(zhǎng)和真菌的侵染，從而提高了試管苗的抗逆性和對(duì)環(huán)境條件變化的適應(yīng)能力，提高了移栽成活率。煉苗期溫室內(nèi)的溫度一般要求白天23～27℃，夜間不低于10℃。移栽方法采用單芽莖段或雙芽莖段扦插式移栽。邊剪取邊扦插。扦插基質(zhì)可采用滅過(guò)菌的珍珠巖或疏松土壤。扦插成活后每隔2～3d噴1次營(yíng)養(yǎng)液(表4—5)、后期每隔10d噴1次，以促進(jìn)扦插苗健壯和順利結(jié)薯。微型薯生產(chǎn)技術(shù)由試管苗生產(chǎn)的重1～30g的微小馬鈴薯稱(chēng)為微型薯。雖然溫室或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生微型薯，但以實(shí)驗(yàn)室內(nèi)誘導(dǎo)生產(chǎn)為主，為馬鈴薯的種質(zhì)保存、交換以及脫毒種薯的繁育和運(yùn)輸提供了一種便利的途徑，也便于馬鈴薯種薯的大面積推廣。1、實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)微型薯組織培養(yǎng)生產(chǎn)微型薯要求條件較嚴(yán)格，費(fèi)用較高，但產(chǎn)品的質(zhì)量好，整齊度高，粒重一般只有1～5g，由于是在三角瓶中或試管中培養(yǎng)，因此可作為不帶病原菌的原種使用，或作為基礎(chǔ)研究材料和病原鑒定的實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)室微型薯生產(chǎn)(圖1)一般分單莖段擴(kuò)大繁殖和微型薯誘導(dǎo)兩個(gè)階段。單莖節(jié)擴(kuò)大繁殖從試管苗中獲得莖切段，每個(gè)切段上帶有1～2個(gè)葉片和腋芽。每個(gè)三角瓶中接4～5個(gè)莖段進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件是溫度22℃，光照16h/d，光強(qiáng)10001x。所采用培養(yǎng)基：①節(jié)段培養(yǎng)基：MS十3％蔗糖十0.8％瓊脂；②液體振蕩培養(yǎng)基：MS十2％蔗糖；③微型種薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS十香豆素50～100mg/L；④離體保存培養(yǎng)基：MS十3％蔗糖十4％甘露醇十0.8％瓊脂。在此條件下，由腋芽形成的小植株生長(zhǎng)很快，當(dāng)小植株長(zhǎng)到4～5cm時(shí)，就可以進(jìn)行第二步培養(yǎng)。2、溫室生產(chǎn)微型薯一般采用脫毒苗切繁方法進(jìn)行。為了節(jié)約土地，充分利用空間，有人專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)了溫室多層架盤(pán)工廠化生產(chǎn)微型薯的方法。具體方法是：在溫室4～6層育苗架上放育苗盤(pán)，基質(zhì)可以是蛭石、珍珠巖等。將脫毒試管苗以單莖段或雙芽莖段扦插，然后在人工調(diào)控的溫光條件下經(jīng)60～90d即可收獲微型薯。扦插時(shí)用3mg/LGA十5mg/LNAA的混合液浸泡莖段，扦插成活率達(dá)98％。果樹(shù)的組織培養(yǎng)

一、蘋(píng)果的組織培養(yǎng)蘋(píng)果(Malus

pumila)為薔薇科蘋(píng)果屬的落葉喬木，是世界上最主要的果樹(shù)之一。目前，我國(guó)蘋(píng)果的栽培面積和總產(chǎn)量均居世界第一。蘋(píng)果栽培時(shí)會(huì)受到多種病毒危害，主要有蘋(píng)果花葉病毒、蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒、蘋(píng)果腿綠葉班病毒、蘋(píng)果莖痘病毒和蘋(píng)果莖溝病毒等。通過(guò)熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)是培育蘋(píng)果脫毒苗最主要的途徑，而通過(guò)莖段培養(yǎng)能夠快速繁殖蘋(píng)果脫毒苗。脫毒與快繁工藝流程脫毒處理與培養(yǎng)選擇品種純正、生長(zhǎng)健壯、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)成年樹(shù)的接穗嫁接于砧木上。接穗發(fā)芽后在生長(zhǎng)旺季，將植株置于38℃條件下生長(zhǎng)25～50d，然后選取新梢頂部1～2cm進(jìn)行消毒。消毒方法一般為先用70％～75％的酒精浸泡30s左右，再用10％的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min或用0.1％升汞液浸5～7min，最后用無(wú)菌水洗3～5次。切取消毒過(guò)的0.1～0.3mm微莖尖(帶2個(gè)葉原基)接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基可選用MS十6-BA0.5mg/L十CH300mg/L或LS十6-BA2mg/L十CH(或LH)300～500mg/L。先在25～30℃、光下培養(yǎng)7～10d，當(dāng)莖尖膨大轉(zhuǎn)綠后再轉(zhuǎn)入暗培養(yǎng)，能夠加快莖尖的生長(zhǎng)，形成黃化苗。一股在暗培養(yǎng)中增殖2～3代。隨后將黃化苗再轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500～20001x，使苗變綠且生長(zhǎng)健壯。脫毒苗快繁技術(shù)

1．繼代增殖從已確認(rèn)脫毒的蘋(píng)果試管苗上切取莖段，接種到MS十6-BA0.5～lmg/L十CH300mg/L的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽苗。每4～8周繼代1次，每個(gè)月可增殖5～10倍。

2．生根培養(yǎng)切取2cm以上的帶頂芽的莖段，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基可選擇l/2MS或其他低鹽的基本培養(yǎng)基，附加IAAlmg/L、IBA0.2Mg/L和GA33mg/L，可有效地促進(jìn)生根。也可以不通過(guò)生根培養(yǎng)，直接將芽片嫁接到已無(wú)病毒的蘋(píng)果矮化砧木上，進(jìn)行微嫁接培養(yǎng)。這樣既可以保持樹(shù)體有良好的矮化特性，又可通過(guò)采用脫毒繁殖材料妥善地解決脫毒苗的繁殖問(wèn)題。對(duì)生根困難的蘋(píng)果砧木Mq的試管苗生根，可以先接種在LS十IBA2mg/L十根皮酚162mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～7d后，再轉(zhuǎn)入無(wú)激素的LS培養(yǎng)基，這樣生根快而頻率高。

3．馴化移栽蘋(píng)果脫毒苗通過(guò)沙培2～3周馴化后，栽植到土壤或河沙中。沙培期間可澆灌1/4MS+IAA1～1.5mg/L的營(yíng)養(yǎng)液，其成活率可達(dá)40%左右。草莓的組織培養(yǎng)草莓(Fragaria

spp.)為薔薇科多年生草本植物，是重要的漿果植物。其果實(shí)顏色鮮艷，營(yíng)養(yǎng)豐富，可鮮食，是良好的配餐食品，也可加工成果醬，果酒等。其促成栽培的迅速發(fā)展，填補(bǔ)了水果的淡季市場(chǎng)。草莓的繁殖主要采用匍匐莖分株繁殖，雖然繁殖容易，但效率較低，占地多，易遭受病毒侵害，引起品種退化，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能夠快繁優(yōu)質(zhì)草莓種苗，利于品種的提純和更新，而且能夠脫除草莓體內(nèi)的病毒。脫毒與快繁技術(shù)1．熱處理脫毒草莓植株先栽種用于熱處理的特定容器內(nèi)生長(zhǎng)1～2個(gè)月，使其根系健壯生長(zhǎng)，以增加對(duì)高溫的抵抗能力。然后放入恒溫箱中，保持光照16h/d，光強(qiáng)50001x，晝溫38℃，夜溫35℃。處理的時(shí)間因病毒種類(lèi)而異。如38℃的恒溫培養(yǎng)12～15d即可脫去草莓斑駁病毒；草莓輕型黃斑病毒和草莓鑲脈病毒，因耐熱性強(qiáng)，需在38℃恒溫條件下處理50d方能有效。熱處理之后再進(jìn)行微莖尖培養(yǎng)則脫毒比較徹底，即便所取微莖尖稍大一點(diǎn)，也可以培育出無(wú)病毒苗，且能提高外植體的成活率。

2．微莖尖培養(yǎng)脫毒與快繁(1)外植體的選擇與處理取經(jīng)過(guò)熱處理的草莓母株上新抽出的匍匐莖作外植體，以每年6～7月份最為適宜。如果母株沒(méi)有經(jīng)過(guò)熱處理，則于7～8月份匍匐莖發(fā)生最旺盛的時(shí)期，在無(wú)病蟲(chóng)害的田塊，連續(xù)晴天3～4d時(shí)選取生長(zhǎng)健壯、新萌發(fā)且未著地的匍匐莖梢3cm長(zhǎng)作外植體。然后用肥皂水洗刷——流水沖洗2h——?jiǎng)內(nèi)ネ鈱尤~片——75％的酒精30s，除去表面的蠟質(zhì)——2％～3％次氯酸鈉溶液(加數(shù)滴0.1％吐溫-20或80)15～20min——無(wú)菌水沖洗3～5次的順序進(jìn)行材料表面滅菌，最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。在無(wú)菌條件下借助解剖鏡將芽外面的幼葉和部分葉原基除去，使生長(zhǎng)點(diǎn)暴露，然后用解剖刀切下帶有1～2個(gè)葉原基、0.2～0.5mm大小的微莖尖，迅速接人MS十BA0.5mg/L十NAA0.25mg/L或White十IAA0.1mg/L的初代培養(yǎng)基上。

(2)初代培養(yǎng)微莖尖接種后置于(25±2)℃、光照16～18h/d，光強(qiáng)2000～3000lx的條件下培養(yǎng)。L～2個(gè)月后莖尖生長(zhǎng)并分化出芽叢。若在低溫和短日照條件下，莖尖可能進(jìn)人體眠，所以應(yīng)保持較高的溫度和充足的光照時(shí)問(wèn)。

(3)繼代培養(yǎng)將芽叢切割成有3～4個(gè)芽的芽叢轉(zhuǎn)人MS十6-BAlmg/L繼代培養(yǎng)基上，每瓶放置3～4個(gè)芽叢，經(jīng)過(guò)3～4周的培養(yǎng)可獲得由30～40個(gè)腋芽形成的芽叢。在轉(zhuǎn)接過(guò)程中，去掉原生葉片有利于新苗的分化；增殖培養(yǎng)中隨時(shí)清除愈傷組織，有利于芽苗的增殖和生長(zhǎng)。在轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基前一次繼代培養(yǎng)時(shí)，改換培養(yǎng)基為MS十6-BA0.5mg/L，以利于形成壯苗o(4)生根培養(yǎng)將長(zhǎng)到2cm長(zhǎng)的草莓苗接種到1/2MS十IBA0.1mg/L的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生根率達(dá)100％，平均根條數(shù)為2．4條。培養(yǎng)基中不附加IBA或IBA濃度超過(guò)0.2mg/L，多數(shù)芽苗都在基部切口處產(chǎn)生愈傷組織，隨后在愈傷組織上分化生根，致使成活率大大降低。另外，也可以將具有兩片以上正常葉的芽苗在試管外生根。

(5)馴化和移栽當(dāng)生根培養(yǎng)15～20d時(shí)，試管苗根多且粗壯。當(dāng)主根長(zhǎng)1．5cm左右，白色無(wú)須根、葉大而厚、深綠，具3片以上葉片時(shí)可以馴化移栽。栽培基質(zhì)為腐熟的鋸木屑或腐葉土，也可采用蛭石與珍珠巖配比為1：1或園土與煤渣配比為2：1的復(fù)合基質(zhì)。溫室內(nèi)或塑料拱棚內(nèi)溫度要控制在15～20℃，濕度維持在80％左右為宜。同時(shí)由于剛移栽的小苗莖稈脆嫩，應(yīng)盡量采用噴霧澆水，水量不宜過(guò)大，干后再?lài)姟Ｒ圃猿跗谡诠?0％，1周后逐漸增加光強(qiáng)。這樣試管苗移栽成活率可達(dá)90％～100％。

花卉的組織培養(yǎng)

一、百合的組織培養(yǎng)百合(Li