DB21T 2537-2015 藍(lán)舌病病毒熒光PCR檢測(cè)方法

DB21DB21/T2537—2015藍(lán)舌病病毒熒光PCR檢測(cè)方法Methodofthereal-timeRT-PCR遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)DEPC：焦碳酸乙二酯（DiethylTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAciTranscriptionPolymeraseChainReacti采用TaqMan方法，比對(duì)藍(lán)舌病病毒基因組S基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物和特異性的熒光雙標(biāo)記探針進(jìn)行配對(duì)。探針5'端標(biāo)記FAM熒光素為報(bào)告熒光基團(tuán)（用R表示），3'熒光信號(hào)。PCR反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基因所吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，不再為Q所吸收而被檢測(cè)儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長(zhǎng)呈5試劑和材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)5.1試劑5.4.20.01mol/LPBS（見(jiàn)5.4.4三氯甲烷。5.4.5乳糖蛋白胨緩沖肉湯（BLP,見(jiàn)附錄5.4.7異丙醇（-20℃預(yù)冷）。（pH8.3見(jiàn)附錄A）,2.5mmol/LMgCl2（見(jiàn)附錄A）?？刹捎玫刃唐坊噭?。5.4.9dNTPMixture(各10mM)、Taq酶(5U/μL)。5.2儀器與耗材5.4.3微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL5.4.10離心管5.4.11微量帶芯吸嘴（10μL6生物安全要求采樣過(guò)程中樣本不得交叉污染，采樣及樣品前處理過(guò)程中應(yīng)戴一次用無(wú)菌的剪刀剪取待檢樣品5.0g后，再加10m鏈霉素2000μg/ml)加入于研缽中充分研磨，4℃浸提4h,取上清液5ml用超聲取加入肝素（10IU肝素/5ml）抗凝血5ml，用磷酸鹽緩沖液(PBS,配4℃10000g離心15min。將水相轉(zhuǎn)移到新管中，加離心5s，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增或放置于-7），將7.4.1中離心后的PCR管放入實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)參數(shù)設(shè)——第三階段，94℃20s、45℃8結(jié)果判定8.4.3如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照條件不滿(mǎn)足以上條件，此實(shí)驗(yàn)視Ct值≤30，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，表示樣品中存在藍(lán)舌A.1DEPC水去離子水按0.1%加入DEPC，37℃靜置過(guò)夜，采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高壓滅菌后稱(chēng)取17g氯化鈉，用適量蒸餾水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸餾水定容至2L。采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高壓A.375％乙醇溶液量取75ml無(wú)水乙醇溶液，加入雙蒸水中，充分混勻，定容至100A.450mmol/L氯化鉀（50mmol/LK稱(chēng)取3.73g氯化鉀，加入雙蒸水，充分溶解，定容至1000mlA.62.5mmol/LMgCl2稱(chēng)取0.059gMgCl2，用雙蒸水溶解，定容A．