生物素材：教材梳理專題課題菊花的組織培養(yǎng)

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精庖丁巧解牛知識(shí)?巧學(xué)一、植物組織培養(yǎng)的基本過(guò)程1。細(xì)胞分化植物的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上都會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性的差異，形成這些差異的過(guò)程叫做細(xì)胞分化。高等生物一般都從一個(gè)受精卵開始發(fā)育，經(jīng)多次細(xì)胞分裂與分化,產(chǎn)生出各種不同的特殊結(jié)構(gòu)和專一功能的細(xì)胞。例如，植物體中的木纖維、韌皮纖維等。已分化的細(xì)胞，其基因組成并未改變，并無(wú)遺傳信息的增減，仍具有發(fā)育的全能性。一般認(rèn)為，細(xì)胞分化是細(xì)胞中遺傳信息有選擇地表達(dá)的結(jié)果。2。細(xì)胞的全能性細(xì)胞全能性比較權(quán)威的定義是1984年國(guó)際組織培養(yǎng)協(xié)會(huì)做出的：“細(xì)胞全能性為細(xì)胞的某種特征，有這種能力的細(xì)胞保留形成有機(jī)體所有細(xì)胞類型的能力”.這個(gè)定義比一般所說(shuō)的概念“一個(gè)細(xì)胞中包含著這種生物的全部遺傳信息（基因），在適當(dāng)?shù)臈l件下可以發(fā)育成一個(gè)完整的生物體”更基本和全面。它不但包含了培養(yǎng)細(xì)胞再生成植株的情況（分化成各種類型的細(xì)胞，并以一定形式構(gòu)建成植物）,同時(shí)也包含了培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝物的情況（不分化或只分化成某種類型細(xì)胞，但仍留著分化為其他細(xì)胞類型的能力）。前者成為組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植物需要進(jìn)行植株再生的理論基礎(chǔ)，后者成為像微生物發(fā)酵一樣培養(yǎng)細(xì)胞,生產(chǎn)人們所需要的次生代謝產(chǎn)物的理論基礎(chǔ)，如通過(guò)紅豆杉的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇.難點(diǎn)培析(1）全能性的含義：生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整的個(gè)體的潛能。(2）全能性的基礎(chǔ)：每個(gè)體細(xì)胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體的全部基因.（3）全能性程度：由高到低依次是受精卵→生殖細(xì)胞→體細(xì)胞。（4）表現(xiàn)全能性的條件:①離體②營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)③激素。(5）與植物和低等細(xì)胞相比，高等動(dòng)物體細(xì)胞的發(fā)育潛能有顯著差異。3.植物組織培養(yǎng)的過(guò)程植物組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下,對(duì)離體植物組織（器官或細(xì)胞）分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長(zhǎng),甚至分化發(fā)育成完整植株的一項(xiàng)技術(shù).植物組織中原本已經(jīng)分化的細(xì)胞，一旦脫離原有的機(jī)體環(huán)境,成為離體狀態(tài)，在適宜的營(yíng)養(yǎng)和外界條件下，就會(huì)表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細(xì)胞，脫分化成為恢復(fù)分裂能力的細(xì)胞，叫做愈傷組織。愈傷組織的排列疏松而無(wú)規(guī)則,是一種高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，又可以重新分化為根或芽等器官,這個(gè)過(guò)程稱為再分化。再分化形成的試管苗移栽到地里，可以發(fā)育成完整的植株.深化升華植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞的全能性。植物組織培養(yǎng)的過(guò)程可歸納為：離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根、芽→完整的植物體二、影響植物組織培養(yǎng)的因素1.外植體的生理狀態(tài)是成功進(jìn)行組織培養(yǎng)的重要條件之一外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理狀況而有很大差別,如煙草、胡蘿卜等脫分化較易，而禾谷類的脫分化較難；花器脫分化較易,而莖葉較難;幼嫩組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。對(duì)于同一種植物材料，材料的年齡、保存時(shí)間的長(zhǎng)短等也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效果。要點(diǎn)提示生長(zhǎng)旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。菊花的組織培養(yǎng),一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝。2。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng).常用的一種培養(yǎng)基是ＭＳ培養(yǎng)，它是1962年由Ｍurashige和Ｓkoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的.特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適,可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好.MS培養(yǎng)基的主要成分包括：大量元素、微量元素、有機(jī)物等.在配制好的MS培養(yǎng)基中,常常需要添加植物激素。(1）大量元素，指濃度大于0.5mol/L的元素，有N、Ｐ、Ｋ、Ｃa、Ｍg、Ｓ等.（2）微量元素，指濃度小于0.5mol/L的元素，有Ｆe、Ｂ、Ｍn、Ｃu、Ｍo、Ｃo等。(3）有機(jī)物,包括碳水化合物、維生素、肌醇、氨基酸等.①碳水化合物，最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。②維生素,維生素類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多項(xiàng)代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化等有很好的促進(jìn)作用。③肌醇，在適當(dāng)?shù)那闆r下使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用,對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。④氨基酸，是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他種類,如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。⑤植物激素,是植物組織培養(yǎng)中發(fā)揮生物學(xué)效力最強(qiáng)的培養(yǎng)因素，也是人工調(diào)控組織培養(yǎng)的“魔術(shù)棒"。在植物組織培養(yǎng)中最常用的是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的協(xié)同調(diào)控作用在組織培養(yǎng)中很重要，即所謂的“激素杠桿”。激素的生物學(xué)效應(yīng)是組織內(nèi)源激素和人工添加的外源激素效應(yīng)的總和。只有準(zhǔn)確把握內(nèi)源激素與外源激素的協(xié)同作用，才能有效地操作“激素杠桿”，做好植物組織培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成,誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在促進(jìn)生長(zhǎng)方面,根對(duì)生長(zhǎng)素最敏感.在極低的濃度（10-5～10—8mg/L)下,就可促進(jìn)生長(zhǎng)。天然的生長(zhǎng)素?zé)岱€(wěn)定性差,高溫高壓或受光條件易被破壞.在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長(zhǎng)素類物質(zhì)。細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：首先是誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相互作用，當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值高時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽;其次是促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大；再次是抑制根的分化.因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化,莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。疑點(diǎn)突破生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的使用順序不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同；同時(shí)使用時(shí),兩類激素的比例決定著發(fā)育的細(xì)胞類型，決定著愈傷組織再分化，是長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長(zhǎng)素的濃度,或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。辨析比較微生物培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基的成分比較微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同,MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)機(jī)鹽混合物包括植物生長(zhǎng)必需的大量元素和微量元素兩大類.MS培養(yǎng)基中還含有少量的有機(jī)物、植物激素等.3.溫度溫度是組織培養(yǎng)過(guò)程中的重要因素。組織培養(yǎng)在最適溫度下,生長(zhǎng)分化表現(xiàn)良好，大多數(shù)組織培養(yǎng)都是在23～27℃之間進(jìn)行。不同植物培養(yǎng)的最適溫度不同。4.光照組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一,主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)以及光照時(shí)間方面。光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響。5。pＨ不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適pＨ的要求也是不同的,大多在5～6.5左右，一般培養(yǎng)基皆控制在５。８，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。pＨ適度因材料而異,也因培養(yǎng)基的組成而不同。6.氣體氧氣是組織培養(yǎng)中的必需因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問(wèn)題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥,夏季易引起污染.固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來(lái)增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時(shí),要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。三、實(shí)驗(yàn)操作:菊花的組織培養(yǎng)1。制備MS固體培養(yǎng)基(1）母液的配置和保存大量元素母液可配成10倍液。微量元素母液可配成100倍液。維生素、激素類母液可配成1mg/mL母液。制好的母液瓶上應(yīng)分別貼標(biāo)簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配一升培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)取的量。（2）配制培養(yǎng)基配制1LMS培養(yǎng)基時(shí)，先將稱好的瓊脂加入800mL蒸餾水，加熱使瓊脂熔化,然后加入蔗糖30g,取配制好的大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液，依次加入，加蒸餾水定容至1000mL。(3）培養(yǎng)基配好后，要調(diào)整pH。用0.1M的NaOH或HCl液調(diào)到5。8左右。(4）培養(yǎng)基的分裝與滅菌培養(yǎng)基要趁熱分裝，一般100ml的容器約裝入30~40ml培養(yǎng)基。分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。2.外植體消毒對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行表面滅菌時(shí),一方面要考慮藥劑的消毒效果；另一方面還要考慮植物材料的耐受能力。不同藥劑、不同植物材料，甚至不同器官要區(qū)別對(duì)待.菊花莖段的消毒：流水沖洗加少許洗衣粉用軟刷輕輕刷洗流水沖洗放入70%酒精中搖動(dòng)無(wú)菌水清洗放入0。1%的氯化汞溶液中處理1～2min無(wú)菌水清洗3次。3。接種接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過(guò)程.以上已敘述接種前的材料表面的消毒滅菌，現(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹一遍.(1）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無(wú)菌水沖洗。最后瀝去水分,取出放置在滅過(guò)菌的４層紗布上或?yàn)V紙上.（2）材料吸干后,一手拿鑷子,一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm見方的小塊;莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?～2片幼葉的莖尖大小等。在接種過(guò)程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（3）用灼燒消毒過(guò)的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作是：先解開封口膜，將試管幾乎水平拿著，試管口靠近酒精燈焰，將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，讓管口里外灼燒數(shù)秒鐘，若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面.然后用鑷子夾取一塊外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上.若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1～3塊為宜.接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。將封口膜重新扎好。要點(diǎn)提示材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無(wú)統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向于少放，人們通過(guò)統(tǒng)計(jì)認(rèn)為：對(duì)外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣節(jié)約培養(yǎng)基和人力,一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄。4.培養(yǎng)指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照、溫度條件)里，使之生長(zhǎng)、分裂、分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過(guò)程。5。移栽移栽前應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，使之逐步由無(wú)菌環(huán)境到有菌環(huán)境，由人工培養(yǎng)環(huán)境過(guò)渡到自然環(huán)境。如出瓶苗要使用消毒的土壤、保濕、保溫,同時(shí)還要做一定的壯苗處理，如增加光照和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液等。經(jīng)過(guò)一系列的處理，一株組織培養(yǎng)出來(lái)的“克隆苗”就順利成活了。6.栽培將幼苗移栽后，每天觀察幼苗生長(zhǎng)情況，適時(shí)澆水、施肥,直至開花.難點(diǎn)培析(1)無(wú)菌技術(shù)是植物組織培養(yǎng)能否獲得成功的關(guān)鍵植物組織培養(yǎng)不同于扦插、分根、葉插等常規(guī)無(wú)性繁殖。由于植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，所以對(duì)培養(yǎng)條件的要求較高，對(duì)無(wú)菌操作的要求非常嚴(yán)格。如果不小心引起污染，將可能造成培養(yǎng)工作的前功盡棄。（2）妥善處理被污染的培養(yǎng)物即使對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的操作人員,操作后出現(xiàn)培養(yǎng)物被污染的情況也常有。一般情況下,細(xì)菌污染可能是由接種人員造成的，如未戴口罩，接種時(shí)說(shuō)話,或手及器械消毒不嚴(yán)格等.真菌污染可能是植物材料滅菌不當(dāng)。需要特別注意的是,一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)材料被污染，特別是真菌性污染，一定不要打開培養(yǎng)瓶。應(yīng)先將所有被污染的培養(yǎng)瓶統(tǒng)一放在高壓蒸汽鍋內(nèi)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后再打開培養(yǎng)瓶，進(jìn)行清洗。(3)生根苗移栽技術(shù)的關(guān)鍵生根苗移栽技術(shù)的關(guān)鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系。一般使用無(wú)土栽培的辦法。培養(yǎng)基質(zhì)要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質(zhì)噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12h。掀開塑料薄膜后24h才能移栽。新移栽的組培苗要在溫室過(guò)渡幾天，等壯苗后再定植大田或進(jìn)行盆栽。在課后統(tǒng)計(jì)自己移栽的成活率，看看移栽是否合格.問(wèn)題?探究問(wèn)題1探究組織培養(yǎng)過(guò)程中植物激素的作用。思路：在保證無(wú)關(guān)變量都相同的情況下，設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮怼页鱿嚓P(guān)變量（自變量、因變量、無(wú)關(guān)變量）→確定控制變量的對(duì)照方法→結(jié)合實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案→利用相關(guān)對(duì)照，邏輯推理相關(guān)結(jié)論（或預(yù)期結(jié)果）.探究：第一組：不加任何植物激素；第二組:生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素用量的比值為1∶1；第三組：兩種植物激素用量比值大于1；第四組：兩種植物激素用量比值小于1。觀察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。問(wèn)題2從紅豆杉樹皮中分離出的紫杉醇是當(dāng)今世界公認(rèn)的廣譜、強(qiáng)活性的抗癌藥物，它具有特殊抗癌機(jī)理，能與微管蛋白結(jié)合，并促進(jìn)其聚合、抑制癌細(xì)胞有絲分裂，阻止癌細(xì)胞的增殖。紫杉醇不僅對(duì)卵巢癌、乳腺癌、肺癌有較好的作用,而且對(duì)其他疾病也有一定潛力，因此紫杉醇日益成為許多國(guó)家研究的熱點(diǎn)。而紅豆杉卻面臨滅頂之災(zāi)。我國(guó)紅豆杉資源儲(chǔ)量有限，自1992年美國(guó)FAD正式批準(zhǔn)紫杉醇為治療晚期癌癥藥物以來(lái)，過(guò)度砍伐日益嚴(yán)重，我國(guó)紅豆杉野生資源遭到了嚴(yán)重破壞.紫杉醇含量很低，一般僅為干重的0.006%~0.06%，而且紅豆杉生長(zhǎng)十分緩慢，很多生物學(xué)特性限制了自然種群的發(fā)展，據(jù)WHO組織統(tǒng)計(jì)，世界癌癥的年發(fā)病人數(shù)達(dá)1000多萬(wàn)，預(yù)計(jì)年需紅豆杉樹皮約700噸,即使全球紅豆杉天然資源采伐完,也僅夠短期需要,而且這樣做還會(huì)對(duì)地球環(huán)境和生物多樣性造成不可彌補(bǔ)的損失。請(qǐng)與你的同學(xué)一起探究獲取抗癌藥物紫杉醇的途徑有哪些。思路：獲取抗癌藥物紫杉醇的幾種途徑：紅豆杉的人工種植途徑，植物組織培養(yǎng)途徑，生物合成途徑,化學(xué)合成及微生物生產(chǎn)途徑等。目前組織培養(yǎng)是緩解需求的重要