16s rDNA鑒定微生物原理

微生物鑒定原理匯報(bào)人：王偉STEP01STEP02STEP03STEP04微生物鑒定原理微生物定義、分類16srDNA鑒定細(xì)菌原理ITS鑒定真菌原理目錄CONTENTS22021/6/2701微生物鑒定原理32021/6/27微生物鑒定原理通過(guò)DNA測(cè)序?qū)ξ⑸镞M(jìn)行物種鑒定（菌種鑒定）是比傳統(tǒng)生化鑒定更先進(jìn)的鑒定方法。DNA測(cè)序不依賴菌種本身特點(diǎn)，對(duì)所有菌種均可使用。比傳統(tǒng)生化鑒定更加快速，準(zhǔn)確。42021/6/2702微生物定義、分類52021/6/27定義微生物是個(gè)體難以用肉眼觀察的一切微小生物的統(tǒng)稱。分類微生物定義、分類微生物包括：細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它個(gè)體微小，與人類關(guān)系密切。微生物劃分為以下8大類：細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體。有些微生物是肉眼可以看見(jiàn)的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝等。還有微生物是一類由核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的“非細(xì)胞生物”，但是它的生存必須依賴于活細(xì)胞。62021/6/270316srDNA鑒定細(xì)菌原理72021/6/27100%33％100%66％100%100％16srDNA簡(jiǎn)介鑒定原理鑒定步驟16srDNA鑒定細(xì)菌原理82021/6/270102定義：

16srDNA（16SrRNA為核糖體的RNA的一個(gè)亞基16SrDNA就是編碼該亞基的基因。）鑒定是指用利用細(xì)菌16srDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。

16srDNA是細(xì)菌染色體上編碼16srRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中。16SrRNA與16SrDNA的區(qū)別16S中的"S"是一個(gè)沉降系數(shù)，亦即反映生物大分子在離心場(chǎng)中向下沉降速度的一個(gè)指標(biāo)，值越高，說(shuō)明分子越大。rDNA和rRNA中的小寫字母"r"是ribosome(核糖體)的縮寫。rDNA指的是基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對(duì)應(yīng)的DNA序列，也就是編碼16SrRNA的基因。rRNA指的是rDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它是構(gòu)成核糖體的重要成分，核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成，16SrRNA是其中一個(gè)組件.一般所分析的對(duì)象都是16srDNA，因?yàn)镈NA提取容易，也比較穩(wěn)定。。16srDNA簡(jiǎn)介92021/6/27原因什么原因使得各學(xué)者和分類學(xué)家使用16srDNA鑒定細(xì)菌？16srDNA保守性定義是什么？有什么作用？高變區(qū)什么叫高變區(qū)？怎么樣通過(guò)高變區(qū)鑒定種屬關(guān)系，種間關(guān)系？鑒定原理鑒定原理保守性102021/6/27鑒定原理原因16srDNA由于其種類少，含量大(約占細(xì)菌RNA含量的80%)，分子大小適中，存在于所有的生物中，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性。同時(shí)還含有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，具有高變性?？勺儏^(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將16SrDNA片段擴(kuò)增出來(lái)，利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。112021/6/27鑒定原理保守性定義：基因的保守型指的是某一段序列在進(jìn)化演變的過(guò)程中，在不同的物種都都一直保留。作用：科學(xué)家認(rèn)為這些跨物種的相似性證明了某個(gè)特殊的基因完成了一些許多生命形式所必須的基本功能，因此在進(jìn)化過(guò)程中保留了這些序列。保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，16SrDNA分子的序列特征為不同分類級(jí)別的近緣種系統(tǒng)分類奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。122021/6/27鑒定原理高變區(qū)

細(xì)菌16S核糖體RNA（rRNA）基因含有9個(gè)“高變區(qū)”（V1-V9），其在不同細(xì)菌中表現(xiàn)出相當(dāng)大的序列多樣性。沒(méi)有一個(gè)區(qū)域可以區(qū)分所有細(xì)菌;因此，需要進(jìn)行系統(tǒng)研究，比較每個(gè)區(qū)域?qū)μ囟ㄔ\斷目標(biāo)的相對(duì)優(yōu)勢(shì)。132021/6/27各區(qū)域序列差異性鑒定原理V1V2V3V6V4、5、7、8（核苷酸69-99）V1區(qū)域可用于區(qū)分常見(jiàn)的致病性鏈球菌sp。并區(qū)分金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌（CONS）物種。這個(gè)短序列是設(shè)計(jì)金黃色葡萄球菌特異性探針的理想選擇。

（核苷酸137-242）V2區(qū)域可以將細(xì)菌物種區(qū)分為屬種水平。該區(qū)域還能夠區(qū)分常見(jiàn)的葡萄球菌和鏈球菌病原體以及梭菌，嗜血桿菌和奈瑟氏球菌。V2似乎也是區(qū)分分枝桿菌屬的最佳靶標(biāo)。V2具有100bp的平均長(zhǎng)度，這是DNA探針的相對(duì)大的靶區(qū)域。（核苷酸433-497）V3在區(qū)分細(xì)菌和屬的水平方面與V2類似。V3比V2短（65個(gè)核苷酸對(duì)106個(gè)核苷酸），并且用對(duì)側(cè)翼序列特異的通用引物的V3的PCR擴(kuò)增將導(dǎo)致與V2相比更小的擴(kuò)增子。在一些實(shí)時(shí)PCR測(cè)定中，較小的擴(kuò)增子大小可能是優(yōu)選的（核苷酸986-1043）盡管V6區(qū)域長(zhǎng)度僅為58bp，但它顯示出相當(dāng)大的序列可變性，并能夠區(qū)分大多數(shù)細(xì)菌物種，V6是用于區(qū)分炭疽芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的測(cè)定的最佳靶區(qū)域。（核苷酸576-682,822-879,1117-1173和1243-1294）這四個(gè)高變區(qū)，特別是V5，由于與其他高變區(qū)相比具有更高程度的序列保守性，因此不太適合物種鑒定。這可能導(dǎo)致靈敏度較低的測(cè)定，因?yàn)獒槍?duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)的特異性探針可能不會(huì)與所有擴(kuò)增的靶標(biāo)結(jié)合。142021/6/27010203包括細(xì)菌基因組DNA提取、16srDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。步驟

采用細(xì)菌16SrDNA通用引物對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。

PCR擴(kuò)增鑒定步驟152021/6/2704ITS鑒定真菌原理162021/6/27ITS鑒定真菌原理原理：

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS由于不需要加入成熟核糖體，因此在進(jìn)化過(guò)程中能夠承受更多的變異，屬于中度保守的區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致,種間差異比較明顯。這種特點(diǎn)使ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。利用它可研究種及種以下的分類階元。

真核rDNA的基因片段含有18S，5.8S和28S片段，形成串聯(lián)重復(fù)簇;5SrDNA分別編碼：NTS-非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，ETS-外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，ITS-內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

172021/6/27PPT模板下載：/moban/行業(yè)PPT模板：/hangye/節(jié)日PPT模板：/jieri/PPT素材下載：/sucai/PPT背景圖片：/beijing/PPT圖表下載：/tubiao/優(yōu)秀PPT下載：/xiazai/PPT教程：/powerpoint/Word教程：/word/Excel教程：/excel