DB21T 3698-2023 飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測　

ICS65.120CCSB4621IDB21/T3698—2023 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4縮略語 5稀釋液、培養(yǎng)基及試劑 6設備和實驗器材 7檢驗程序 28采樣 39試樣的制備 310操作步驟 311確證試驗 412結果計算與報告 5附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑 7附錄B（資料性）細菌DNA提取 9DB21/T3698—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：大連三儀動物藥品有限公司、遼寧國托檢測有限公司、江蘇三儀生物工程有限公司、大連工業(yè)大學、彰武縣畜牧業(yè)發(fā)展服務中心。本文件主要起草人：江國托、劉艷、單春喬、李娟、劉秋晨、于洪敏、王巖、趙紅秋、翟宏旭、田晶、陳玲、王效禹、宋蕙男、吳怡琦、劉星、冷寒冰。本文件發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋。我們將及時答復并認真處理，根據(jù)實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：大連三儀動物藥品有限公司，遼寧省大連市甘井子區(qū)營城子鎮(zhèn)營旭路9號，聯(lián)系電話1DB21/T3698—2023飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測本文件規(guī)定了飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測方法。本文件適用于各種飼料添加劑各組分中丁酸梭菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.2食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。FTGFluidThioglycollate，液體硫乙醇酸鹽5稀釋液、培養(yǎng)基及試劑5.10.85%滅菌生理鹽水。5.2丁酸梭菌培養(yǎng)基：見附錄A中的A.1。5.3革蘭氏染色液：見附錄A中的A.2。5.4細菌生化鑒定試劑盒。5.5細菌基因組DNA提取試劑盒。5.6標準菌株：丁酸梭菌CICC10390。5.7實驗室用水:按照GB/T6682進行。6設備和實驗器材2DB21/T3698—20236.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。6.2漩渦震蕩器：0～2800rpm。6.3顯微鏡：1000倍。6.4高壓滅菌鍋：105～134℃。6.5無菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿Φ=90mm。6.6無菌錐形瓶250mL。6.7無菌玻璃或塑料涂布棒。6.8無菌吸管：1mL（具0.1mL刻度）和10mL（具0.5mL刻度）。6.9微生物鑒定儀。6.10電子天平：感量為0.1g、0.01g、0.0001g。6.114℃冰箱。6.12pH計：精確度0.1。6.13量筒：250mL。6.14普通PCR儀。6.15電泳儀。6.16凝膠成像儀。7檢驗程序丁酸梭菌檢驗程序見圖1。3DB21/T3698—2023圖1丁酸梭菌檢驗程序8采樣實驗室樣品真實，具有代表性。采樣工具，如鏟子、匙、采樣器、試管、廣口瓶、剪子等，應是無菌器皿。采樣后，樣品應及時送至微生物檢驗室進行檢測。采樣數(shù)量和方式按照GB/T14699.1執(zhí)行。9試樣的制備按照GB/T20195進行。10操作步驟10.1檢樣制備與稀釋以無菌操作取試樣25g(mL)，注入盛有225mL0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)1min～2min或置振蕩器中振蕩30min，制成1︰10的初始菌懸液。吸取1︰10的初始菌懸液1mL，加入9mL0.85%滅菌生理鹽水，經(jīng)充分混勻后制成1︰100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，按上述操作順序做進一步的10倍系列遞增稀釋的稀釋度。10.2接種和培養(yǎng)選擇2個～3個適宜稀釋度，每個梯度3個平行，用無菌移液器分別吸取0.1mL稀釋液，接種到改良FTG培養(yǎng)基上，pH7.0±0.2。使用無菌的涂布棒快速、準確地涂布接種于培養(yǎng)基表面，涂布棒不應接觸平皿邊緣。每個平皿用一支無菌涂布棒。將涂布好的平皿蓋好，室溫中放置15min，使接種物完全被培養(yǎng)基吸收，倒置于37℃±1℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h±1h。10.3菌落計數(shù)及篩選4DB21/T3698—2023培養(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30個～300個之間的平板計數(shù)，若平板中有較大片狀菌落生長時，則不宜采用；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。培養(yǎng)后的平板內(nèi)的培養(yǎng)基顏色由粉色變成淡黃色，典型丁酸梭菌菌落形態(tài)呈端圓，白色，稍凸，不透明，表面菌落稍有不規(guī)則。11確證試驗11.1菌種制備自平板上挑取單菌落，劃線轉接培養(yǎng)于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃±1℃嚴格厭氧培養(yǎng)24h±1h，從平板上選取至少5個良好分離的特征菌落，轉接保存，進行確證試驗。11.2形態(tài)觀察自轉接平板上挑取典型單菌落，做革蘭氏染色鏡檢。丁酸梭菌為革蘭氏陽性菌，顯微鏡觀測菌體呈梭狀，有芽孢，芽孢呈橢圓形，中生或近中生。11.3生化確認試驗目前商業(yè)上的生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，如果采用的培養(yǎng)基與本標準確證試驗所用的培養(yǎng)基一致，可以按照商品說明書使用這些試劑盒或生化鑒定管進行該項確證試驗。將挑選純化的單一菌落，用生化鑒定試劑盒或者生化鑒定管或者微生物鑒定儀按說明進行鑒定試驗。丁酸梭菌生化特征見表1。表1丁酸梭菌生化特征+++-++--+-11.4PCR確證試驗11.4.1DNA提取用商用細菌基因組DNA提取試劑盒或常用提取方法（附錄B）提取試樣DNA，并設置陰性、陽性對照。11.4.2擴增引物序列上游引物：F5′-CTTTATTTGGAGTAGCACCT-3′；5DB21/T3698—2023下游引物：R5′-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3′。PCR反應體系如表2所示。預計擴增產(chǎn)物大小為171bp。11.4.3PCR反應PCR反應體系見表2。表2PCR反應體系51311.4.4程序設定程序設定如下：①預變性：95℃5min；②變性：95℃30s；③退火：55℃30s④延伸：72℃30s；⑤保溫：4℃10min。步驟②至④的循環(huán)數(shù)設為35。11.4.5電泳用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.0%瓊脂糖凝膠，加入Gelred染料。取5μLPCR擴增產(chǎn)物，進行點樣。用DNA分子量標記物做參照。3V/cm～5V/cm恒壓電泳，電泳30min，電泳檢測結果用凝膠成像儀記錄并保存。11.4.6確證結果11.4.6.1當陽性對照孔出現(xiàn)171bp擴增帶，陰性對照孔未出現(xiàn)目的條帶時,試驗結果成立。11.4.6.2被檢樣品出現(xiàn)171bp擴增帶，丁酸梭菌陽性；未出現(xiàn)相應擴增帶的樣品判為陰性。12結果計算與報告12.1菌落計數(shù)只計算符合10.3的菌落。菌落計數(shù)后，隨機挑取5個菌落進行鑒定，根據(jù)證實為丁酸梭菌菌落數(shù)計算出該皿內(nèi)的菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每g（mL）樣品中的菌數(shù)，按式（1）計算：式中：6DB21/T3698—2023A—測定的丁酸梭菌菌落數(shù)，CFU/g(mL)。B—丁酸梭菌的可疑菌落總數(shù)。C—5個鑒定的菌落中確認為丁酸梭菌的菌落數(shù)。f—稀釋倍數(shù)。最終結果按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則修約至整數(shù)。示例：含有丁酸梭菌的樣品中106稀釋液在培養(yǎng)基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落為100個，取5個鑒定，證實為丁酸梭菌的是4個，由1g飼料中含丁酸梭菌菌數(shù)為：12.2樣品中丁酸梭菌菌數(shù)的計算方法與報告選擇兩個連續(xù)稀釋度平板（每個稀釋度至少有一塊平板，其上經(jīng)確證后的丁酸梭菌數(shù)介于30個～300個之間），通過式（2）計算，即為1mL或1g樣品中的丁酸梭菌菌數(shù)N：式中：N 樣品中丁酸梭菌菌落數(shù)； 所有平板經(jīng)確證后的丁酸梭菌菌數(shù)的總和；V 平板的接種體積，單位為毫升（mL）；n1----------第一個稀釋度的平板數(shù)；n2----------第二個稀釋度的平板數(shù)；d----------第一個稀釋度的稀釋因子（未經(jīng)稀釋的液體樣品的d值）。按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則將計算出的結果保留至兩位有效數(shù)字，也可將樣品的丁酸梭菌菌落數(shù)記錄為1.0--9.9乘以10的指數(shù)冪表示。報告每mL或每g樣品的丁酸梭菌估計數(shù)，單位CFU/g（mL）。示例1：若第一個稀釋度（10-4）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為137和201，第二個稀釋度（10-5）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為34和56，則：式中：按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中含丁酸梭菌估計數(shù)為19454545CFU/g（mL）或1.9×107CFU/g（mL）。示例2：若只有最后一個稀釋液（10-5）經(jīng)證實含丁酸梭菌菌落數(shù)為121和135，則：式中：按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中丁酸梭菌估計數(shù)為128000000CFU/g（mL）或1.3×108CFU/g（mL）。7DB21/T3698—2023（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑A.1改良FTG培養(yǎng)基A.1.1成分胰蛋白胨15g酵母粉5g葡萄糖10g硫代乙醇酸鈉3gL-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g氯化鈉2.5g瓊脂20g刃天青0.001g蒸餾水1000mLA.1.2制法將上述成分加于蒸餾水中，調(diào)pH值至7.0±0.2，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15min。A.2革蘭氏染色A.2.1結晶紫染色液A.2.1.1成分結晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液A.2.1.2制法20mL80mL將結晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.2.2革蘭氏碘液A.2.2.1成分碘碘化鉀蒸餾水300mLA.2.2.2制法將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。A.2.3沙黃復染液8DB21/T3698—2023A.2.3.1成分沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mLA.2.3.2制法將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.2.4染色法將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染色1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色，約30s，水洗；滴加沙黃復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。9DB21/T3698—2023細菌DNA提取B.1細菌DNA提取步驟B.1.1細菌培養(yǎng)細菌接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過夜。B.1.2細菌收集取1mL培養(yǎng)物于1.5mL無菌EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1mLTE（pH8.0）中或ddH2O中。B.1.3菌體裂解