DB21T 3378-2021 遼寧省松材線蟲病檢驗鑒定技術(shù)規(guī)程　

DB21TechnicalregulationonquarantineforthepinewiltdiseaseinL遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 2 2 3 3 5 6 8 歸口管理部門通訊地址：遼寧省林業(yè)和草原局（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話：標準起草單位通訊地址：遼寧省林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（遼寧省林業(yè)和草原有（沈陽市和平區(qū)太原北街2號綜合樓B-6），1遼寧省松材線蟲病檢驗鑒定技術(shù)規(guī)程松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus（SteineretBuhrer）Nickle屬于線蟲門（Nematoda側(cè)尾腺綱（Secernentea滑刃目（Aphelenchida滑刃總科（Aphelenchoidoidea滑刃科（Aphelenchoidoidae傘滑亞科（Bursaphelenchinae傘滑刃屬2從表現(xiàn)出異常癥狀的松科植物或松木制品上4.1感病松樹現(xiàn)地取樣方法4.1.1感病松樹典型癥狀4.1.2感病松樹病癥表現(xiàn)時間4.2松木及其制品取樣方法采用貝爾曼漏斗法、淺盤法進行（參見附錄C）。分離時間一般需要4h-12h。將分離液體收集管或者燒杯中，通過自然沉淀或使用離心機處理后得5.2鏡檢5.3培養(yǎng)5.4形態(tài)特征3根據(jù)松材線蟲的形態(tài)特征、松材線蟲和擬松材線蟲形態(tài)5.5檢驗記錄常用的分子生物學鑒定方法有松材線蟲PCR檢測、松材線蟲自動化分子檢測和實時熒光PCR檢測。4℃恒溫箱，一般在1個月內(nèi)完成分離檢驗。），省級檢驗鑒定機構(gòu)應(yīng)當在收到送檢樣品10個工作日內(nèi)出具檢驗鑒定報告報告樣式參見附錄I）檢驗鑒定結(jié)果可能為新增松材線蟲病疫區(qū)和疫點時，省級檢驗鑒定機構(gòu)應(yīng)當在檢驗鑒定后3個工作省級檢驗鑒定機構(gòu)每半年需將檢驗鑒定開展情況上報省林業(yè)和草原行政主管部門所屬的防治檢疫45雌蟲：A.整體；F.體前部；G.陰門區(qū)；H-J6優(yōu)先抽取尚未完全枯死或剛枯死的松樹?？蓞⒄找韵绿卣鬟x擇取樣松如果檢驗有則不需要繼續(xù)取樣，如果沒有要繼續(xù)取樣檢驗，直至全部取樣部之間）、上部（主干與主側(cè)枝交界處）3個部位取樣。對于僅部分枝條表現(xiàn)癥狀的，在其表現(xiàn)癥狀的枝條上取樣。對于樹干內(nèi)發(fā)現(xiàn)媒介昆蟲蛹的，優(yōu)先在蛹室在取樣部位剝凈樹皮，用砍刀或斧頭直接砍取100g-200g木片；或剝凈樹皮，用手搖鉆從木質(zhì)部表面至髓心鉆取100g-200g木屑；或者將枯死松樹伐倒，在取樣部位分別截取2cm厚的圓7原木取樣時在取樣部位剝凈樹皮，直接砍取100g-200g木片；或用手搖鉆從木質(zhì)部至髓心鉆取100g-200g木屑；或分別截取2cm厚的圓盤。松木制品進行取樣時可直接砍取100g-200g木片；或直接帶8將樣品去皮后劈成長約1cm-4cm，直徑1cm-3cm的細條或直接取木屑約10g置于漏斗中的面巾紙，之間，線蟲游離出一定數(shù)量后可鏡檢，一般需要要輕輕打開止水夾，用培養(yǎng)皿或燒杯在橡皮管下接取分離液約10ml；或用離心沉淀管接取分離液9將線蟲分離液取一滴放在載玻片上，將載玻片在酒精燈火焰上來回移動5s-6s，加熱過度會破壞線蟲體內(nèi)器官或使其表皮熟化變白，影響觀察。也可以將線蟲分離液放在試管中，把試管放在60℃-65℃cinerea)或盤多毛孢（Pestalotiaspp.)，此外用鐮刀孢（F下將盤多毛孢、鐮刀孢或灰葡萄孢接種在PDA平板上，盤多毛孢或鐮刀孢28℃恒溫培養(yǎng)4d-5d，灰葡萄前體部特征雄蟲尾部弓形雌蟲尾部指形雌蟲尾部短尾尖突擬松材線蟲B.muctonatus（MamiyaetEnda）在形態(tài)學和生物學方面都松材線蟲廣泛，在松材線蟲病的檢驗中常常可見，二者在形態(tài)上的主要區(qū)別在于：(表尖突，不超過2μm，一般為1μm圓錐形，末端有明顯的尾尖突，長度在3.5μm-5μm線蟲與裂解液置于離心管中。置于PCR儀，70℃條件下保溫處理35min，在95℃條件下保溫處理10min反應(yīng)混合液在98℃預(yù)變性5s，進入循環(huán)98℃變性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共30個循環(huán)，最PCR擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電時間為30min。置凝膠于302nm透射紫外注：泳道M-標準DNA；47-49松材線蟲；50-松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)48，松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)1121314151617181正向引物序列：5’-GAGCAGAAACG反向引物序列：5’-CGTAAAACAGATGGT循環(huán)閾值（Cyclethresholdvalue）Ct值：是在PCR擴增過程中，熒光信號開始由本階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，是實時熒光定