DB37T 3126-2018 禽波氏桿菌免疫熒光檢測技術(shù)規(guī)范　　

DB37DB37/T3126—2018禽波氏桿菌免疫熒光檢測技術(shù)規(guī)范山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3126—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省動物疫病預(yù)防與控制中心負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：朱瑞良、胡莉萍、魏凱、黃河、楊萍萍、孫振紅、彭軍、張華杰、萬吉國。1DB37/T3126—2018禽波氏桿菌免疫熒光檢測技術(shù)規(guī)范本規(guī)范規(guī)定了禽波氏桿菌病間接免疫熒光檢測技術(shù)的試劑或材料、儀器設(shè)備、禽波氏桿菌外膜蛋白 (OMP)的提取、禽波氏桿菌OMP含量測定、禽波氏桿菌外膜蛋禽波氏桿菌免疫熒光檢測方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)范適用于山東省境內(nèi)從事家禽飼養(yǎng)以及從事家禽防疫活動的單位和個人禽波氏桿菌檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB14925實驗動物環(huán)境及設(shè)施3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件?？捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)靈敏，可測定微克級蛋白質(zhì)含量。3.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑(SDS,即十二烷基硫酸鈉)后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小 (可以忽略電荷因素),可以用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。3.32DB37/T3126—2018先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再應(yīng)抗原(或抗體)。4試劑或材料4.2抗體4.3生化試劑不完全弗氏佐劑、丙酮(分析純)、乙醇(分析純)、甘油(分析純)。5.9分光光度計(380nm~780nm)。6.1將保存的禽波氏桿菌株接種于200mL肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，離心收集過夜培養(yǎng)6.2用10倍體積的含有10mMMgCl?的Tris-HCl(100mMpH7.8)緩沖液懸浮，超聲波破碎(功率為500W、破碎時間60s、間隙60s、反復(fù)破碎10次)。Tris-HC1緩沖液配制按附錄A執(zhí)行。6.4含全膜蛋白的沉淀，用同體積的含2%TritonX-100的Tris-MgCl?緩沖液溶解，室溫下孵育30min6.5沉淀用緩沖液再懸浮，置-20℃保存?zhèn)溆谩?禽波氏桿菌OMP含量測定3DB37/T3126—20187.1.1取16支試管，1支作空白對照，3支用于檢測禽波氏桿菌OMP樣品，其余12支試管分為兩組，每組6支，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.1.2用移液器向每組6支試管中各加入1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液各0.01mL、0.02mL、0.04mL、7.1.3各試管中分別加入5.0mL考馬斯亮蘭G-250試劑，立即在旋渦震蕩器上混勻；空白對照管為0.1mL水與5.0mL考馬斯亮蘭G-250試劑的混合液。7.1.4加完試劑2min~5min后，用塑料或玻璃比色皿在分光光度計上測定各樣品在595nm處的吸7.2.2每支試管的蛋白溶液量加大到1.0mL,加考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5.0mL,根據(jù)測定的8.1將提取的禽波氏桿菌OMP蛋白液與弗氏不完全佐劑混合(V:V=1:1),用漩渦振蕩器乳化，制備禽8.2選取體重2.5kg的健康青紫蘭家兔4只，頸背部皮下注射免疫OMP抗原，共免疫4次，每次間隔8.3最后1次免疫后7d采血，檢測兔血清中禽波氏桿菌抗體的凝集價，凝集價高于1:256以上時采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?取臨床疑似禽波氏桿菌病的雞肝臟組織進(jìn)行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15min,用滅菌PBS(配制方法見附錄A)洗滌3～4次，風(fēng)干。10.1.2陰、陽性組織涂片的制備用移液器吸取5μL培養(yǎng)基培養(yǎng)的禽波氏桿菌菌液進(jìn)行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15min,用滅菌PBS洗滌3～4次，風(fēng)干。正常肝臟組織涂片作為陰性對照。10.2檢測方法10.2.1向涂片中滴加1:10倍稀釋的禽波氏桿菌0MP抗血清100μL,置于37℃濕盒中孵育30min,用PBS洗滌3次。10.2.2加1:100倍稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，置于37℃濕盒中孵育30min,用PBS洗滌3次。10.2.3用吸水紙吸干后滴加甘油，將涂片置于熒光顯微鏡下觀察。11判定標(biāo)準(zhǔn)11.1結(jié)果有效性陽性對照呈現(xiàn)明顯的黃綠色熒光，陰性對照無黃綠色熒光，則檢測結(jié)果有效。11.2結(jié)果判定熒光顯微鏡中出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陽性，用“+”表示；未出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陰性，用“-”表示。陰陽性判定結(jié)果按附錄B執(zhí)行。5DB37/T3126—2018AA(資料性附錄)溶液的配制A.1.15%濃縮膠配制成分配制不同體積SDS濃縮膠所需各成分的體積(mL)5%濃縮膠23468水4.130%Acr-Bis(29:1)0.330.671MTris(pH6.8)0.250.380.750.020.030.040.060.0810%過硫酸銨0.020.030.040.060.08TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01A.1.212%分離膠配制成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積(mL)12%分離膠5水4.030%Acr-Bis(29:1)4.020.01.5MTris(pH8.8)0.050.1510%過硫酸銨0.050.15TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02A.2禽波氏桿菌免疫熒光檢測相關(guān)試劑的配制A.2.11mol/LPBS(pH7.2)的配方氯化鈉氯化鉀磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀雙蒸水6DB37/T3126—20A.2.2普通肉湯培養(yǎng)基的配方蛋白胨10g牛肉膏粉3g氯化鈉5g最終pH7.4±0.2A.2.31mol/LTris-Hcl緩沖液(pH7.8)的配制濃鹽酸(1mol/LHCl)42.0mL雙蒸水定容至1000mL在900mL雙蒸水中加入121.1gTris堿，溶液冷卻至室溫后調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0,然后定容至1000mL,