核酸分子雜交

核酸分子雜交NucleicAcidHybridization1

分子雜交技術(shù)就是利用了核酸分子的變性與復(fù)性原理，使變性的核酸分子與檢測核酸分子在堿基互補(bǔ)的條件下形成雜交雙螺旋的過程。

核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，也是臨床分子檢驗(yàn)的重要技術(shù)。2第一節(jié)核酸分子雜交

的基本原理3變性復(fù)性核酸分子雜交是基于核酸分子的變性和復(fù)性原理的基礎(chǔ)上產(chǎn)生和發(fā)展起來的。4DNA變性是指在物理或化學(xué)因素的作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵斷裂，使雙鏈DNA分子變成兩條單鏈DNA的過程。一、DNA變性與復(fù)性5引起核酸變性的因素酸堿熱變性劑（尿素酰胺）有機(jī)溶劑（乙醇丙酮）62.變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。7變性后DNA其它理化性質(zhì)變化生物活性喪失粘度下降密度增加增色效應(yīng)8波長（nm）相對吸收光值（A值）82℃OD260（A260）9增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)，其溶液OD260增高。10

Tm：雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱為解鏈溫度或融解溫度（meltingtemperature,Tm）。不同的DNA具有不同的Tm值，一般為70~85℃，其大小與G+C含量成正比。熱變性11121.定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性。復(fù)

性2.復(fù)性過程：（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子13復(fù)性過程中的堿基配對14Hybridization15具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈，如：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA，該特性是體外雜交技術(shù)的基礎(chǔ)。雜交一詞指的是互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA分子復(fù)性締合產(chǎn)生雙鏈的雜交分子的過程。16雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA17雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾18

DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性

DNA-RNA雜交雙鏈分子

RNA-RNA雜交雙鏈分子寡核苷酸-DNA或RNA雜交雙鏈分子19二、核酸分子雜交

當(dāng)兩條不同來源的單鏈核酸分子DNA-RNA或DNA-DNA鏈之間存在互補(bǔ)的堿基序列時(shí)，通過堿基互補(bǔ)配對形成雙鏈雜交體的過程，稱為分子雜交（molecularhybridization）或核酸分子雜交

。

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA分類20探針待測核酸

應(yīng)用：(1)檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系（同源性）；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。21概念：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。用途：檢測待檢核酸樣品中的特定基因序列。

(DNA-DNA;DNA-RNA;RNA-RNA)要求：特異性，來源方便核酸探針22標(biāo)記物放射性標(biāo)記非放射性標(biāo)記生物素標(biāo)記地高辛標(biāo)記熒光素標(biāo)記探針(probe)：在核酸變性實(shí)驗(yàn)中，為使雜交體與單鏈核酸分子區(qū)分開來所使用的帶有標(biāo)記的單鏈核酸分子。23FITC異硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基羅達(dá)明人染色體不同熒光素染色結(jié)果

同位素，非放射性同位素：熒光染料、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。24雜交的雙方:1.待測核酸序列：可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。

2.核酸探針：是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。探針(已知核酸片斷，單鏈)待測核苷酸序列(單鏈)25第二節(jié)核酸分子雜交

的基本方法26一、核酸分子雜交的種類（一）按照雜交的反應(yīng)條件分為固相和液相雜交兩類：固相雜交

探針

被測DNA（RNA）在固體支持物上雜交液相雜交

探針

被測DNA（RNA）在液體中雜交271.固相分子雜交（solid-phasehybridization）：是將待測的靶核苷酸鏈預(yù)先固定在固體支持物（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，然后放入含有標(biāo)記探針的雜交液中，進(jìn)行雜交反應(yīng)后，使雜交分子留在支持物上，故也稱為膜上印跡雜交。固體雜交的優(yōu)點(diǎn)：

未雜交的游離探針通過漂洗可容易除去，膜上的雜交分子容易檢測，還能防止靶DNA的自我復(fù)性，所以被廣泛應(yīng)用。28

固相雜交原位雜交Southernblot（檢測DNA）Northernblot（檢測RNA）斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交292.液相雜交（solutionhbridization）指使變性的待測核酸單鏈與已知的核酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。利用層析方法將雜交分子與未雜交分子分開后用液閃儀進(jìn)行計(jì)數(shù)或利用紫外吸收特性變化分析雜交結(jié)果的分子雜交類型。液相雜交又分為：RNA酶保護(hù)分析法、核酸酶S1保護(hù)分析法。30（二）根據(jù)被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：1.Southern雜交：

DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。2.Northern雜交：

RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上或尼龍膜，然后用探針雜交。被檢對象為RNA，探針為DNA或RNA。31二、分子雜交技術(shù)一般過程☆探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素）☆待測核酸樣品制備（分離，純化）☆雜交（液相，固相，原位雜交）☆雜交后處理（去掉非特異雜交分子）☆顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）☆結(jié)果分析32

將瓊脂糖電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上，然后，與核酸探針雜交，檢測DNA的方法。又稱之為DNA印跡。

檢測靶分子為DNA,檢測靶分子是否含有目的基因?？捎糜诨蚪M基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。（一）Southern

Blotting33基本步驟DNA制備、酶切電泳分離原位DNA變性DNA轉(zhuǎn)膜預(yù)雜交、雜交、洗脫雜交結(jié)果檢測2.待測DNA樣品的電泳分離3.凝膠中核酸的變性4.Southern轉(zhuǎn)膜1.待測核酸樣品的制備5.Southern雜交6.雜交結(jié)果的檢測34提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southernblottinghybridization預(yù)雜交提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影預(yù)雜交35帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜(尼龍膜/硝酸纖維素膜)吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程膠內(nèi)變性36細(xì)胞組織化學(xué)試劑裂解細(xì)胞勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞蛋白酶、RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA酚/氯仿除去殘余蛋白質(zhì)DNA（100kb±）乙醇1.待測核酸樣品的制備37部分消化充分消化限制酶消化EEEEEEHHDNA片段：（最長的DNA片段控制在大約2kb）3820001000500250100750121：DNAmarkerDL2,0002：實(shí)驗(yàn)組（EcoRI）0.8~1％非變性瓊脂糖凝膠2.待測DNA樣品的電泳分離39堿變性：DNA原位變性，形成單鏈分子，以便進(jìn)行分子雜交。酸中和：凝膠pH值恢復(fù)中性，以便DNA片段轉(zhuǎn)移。3.凝膠中核酸的變性40轉(zhuǎn)移后，各個(gè)DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置仍然一樣，因而稱為印跡（blot）。瓊脂糖凝膠硝酸纖維素膜印跡（blot）注意：做好方向標(biāo)記4.Southern轉(zhuǎn)膜41

Southern轉(zhuǎn)膜毛細(xì)轉(zhuǎn)移真空轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移42

（250-500g）毛細(xì)管虹吸印跡法434445預(yù)雜交：目的是將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉，降低本底，使背景清晰干凈。甲酰胺20×SSCDenhardt氏溶液鮭精DNASDS雜交：預(yù)雜交液+探針DNA6.Southern雜交預(yù)雜交液5.探針的制備46預(yù)雜交prehybridization概念：為了減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前用封閉物將這些非特異性位點(diǎn)封閉。這一雜交前的處理過程稱為預(yù)雜交。常用的封閉物：（1）變性的非特異性DNA:如鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA，又稱為覆蓋DNA。（2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400、脫脂奶粉47洗膜：高低1×SSC:Na+濃度0.2mol/L2×SSC:Na+濃度0.4mol/L0.2×SSC:Na+濃度0.04mol/L0.1×SSC:Na+濃度0.02mol/LNa+濃度48

X-ray片雜交膜放射自顯影7.雜交結(jié)果的檢測非放射性雜化分子的檢測49分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③50DNA分子雜交的應(yīng)用:

可進(jìn)行DNA片段的定位和分子量的測定

可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析

可用于檢出特異的DNA片段

可用于基因文庫和cDNA文庫的篩選51525253Southern雜交的應(yīng)用

檢測某一基因的大小、拷貝數(shù)、酶切圖譜和它在染色體中的位置；檢測基因點(diǎn)突變53pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNASouthernblottinghybridization54

是指待測RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固-液相雜交，檢測RNA（mRNA）的方法。（二）NorthernBlot樣品是RNA。電泳前，不酶切。電泳前，樣品變性。電泳過程中，樣品保持變性狀態(tài)。電泳后，樣品不再變性，直接轉(zhuǎn)膜。需要特別注意防止RNA被降解。所有器皿都要進(jìn)行處理，盡可能除盡RNA酶。5556

Northern印跡雜交流程圖Northern印跡雜交56Northernblottinghybridization檢測靶分子為RNARNA極易被RNase降解RNA酶抑制劑0.1%DEPC處理水(焦碳酸二乙酯)57與Southern

blotting

hybridization不同之處：不需要限制性核酸內(nèi)切酶酶切。變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等方法。應(yīng)用：檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平。比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。Northernblottinghybridization5859（三）Western印跡（Westernblot）又稱免疫印跡（immunoblotting），常用的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白區(qū)帶轉(zhuǎn)到膜上，通過免疫反應(yīng)，檢測能與可以抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。操作程序：蛋白質(zhì)樣品制備→SDS分離→蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移（印跡）→靶蛋白與抗體（一抗與二抗）的結(jié)合→顯色、分析。59蛋白質(zhì)樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品marker轉(zhuǎn)膜濾紙濾紙膜凝膠緩沖液轉(zhuǎn)移膜樣品marker一抗樣品marker二抗樣品marker熒光顯色劑X膠片曝光樣品markerX膠片對照marker的大小位置，分析目的信號。轉(zhuǎn)移膜轉(zhuǎn)移膜Western印跡的基本過程6061Hours04816

WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20

Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrol.

Western印跡檢測蛋白水平61三種印跡技術(shù)的比較SouthernblotNorthernblotWesternblot62

將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再采用特定的探針進(jìn)行雜交，這種雜交方法稱為斑點(diǎn)雜交（dotblotting）或狹縫雜交（slotblotting）。三、斑點(diǎn)及狹縫雜交63多孔過濾加樣器加樣板支撐板抽真空板接真空泵印跡為圓形的，稱為斑點(diǎn)印跡印跡為線狀的，稱為狹縫印跡64正常對照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3用于特定基因表達(dá)的定性及定量研究用于基因突變的分析65標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交并對其進(jìn)行檢測的一種方法稱原位雜交。四、原位雜交

（insituhybridization）檢測基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與定位檢測染色體中特定基因的位置等可用于基因克隆篩選的菌落原位雜交(裂菌)66基本步驟：原位雜交分為：組織、細(xì)胞的固定預(yù)處理預(yù)雜交、雜交雜交結(jié)果檢測細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片原位雜交（10％甲醛等）（蛋白酶、SDS、TritonX-100）（核素和非核素標(biāo)記探針）67菌落原位雜交68雜交類型檢測目的及范圍Southern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子Westernblot檢測經(jīng)凝膠電泳分離固定在膜上的蛋白質(zhì)分子原位雜交檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子生物芯片批量檢測細(xì)胞或組織樣品中的蛋白質(zhì)69第三節(jié)生物芯片技術(shù)70生物芯片生物芯片（biochip）是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速與大信息量的檢測。71DNA芯片

蛋白質(zhì)芯片

其它芯片生物芯片包括：按用途分：-樣品制備芯片

-生化反應(yīng)芯片-檢測芯片72是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)73基因芯片(genechip)

Cy3Cy574許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針Cy3Cy57576是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理77蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)抗原芯片原理圖78第四節(jié)探針的制備與標(biāo)記79核酸探針（probe）：

探針是指帶有檢測標(biāo)記的，能與被檢測核苷酸片段互補(bǔ)的一段已知核苷酸片段。cDNA探針基因組DNA探針寡核苷酸探針RNA探針探針的種類：80一、合成寡核苷酸探針注意原則(1)長度（10-50bp);(2)G:C對含量40%-60%；(3)探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4)避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。81(1)標(biāo)記前后探針基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;(2)特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；(3)操作簡單、節(jié)時(shí)；(4)安全、無環(huán)境污染。二、標(biāo)記物1、

一個(gè)理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足：822、標(biāo)記物的種類32P、35S、3H、125I等半抗原：生物素（biotin）、地高辛（Dig）熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明等酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等化學(xué)發(fā)光探針非核素標(biāo)記物核素標(biāo)記物83體內(nèi)標(biāo)記體外標(biāo)記化學(xué)法酶法三、標(biāo)記方法缺口平移法隨機(jī)引物標(biāo)記法PCR標(biāo)記法末端標(biāo)記法84利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)）發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上?；瘜W(xué)法：多聚體乙撐亞胺聚苯醌酶（如HRP）交聯(lián)多聚體乙撐亞胺酶DNA戊二醛交聯(lián)85酶法：OH5'5'3'

32P-dATP生物素-dUTPorNTP地高辛-dUTPorNTP

熒光素-dNTP86DNaseI5'5'3'3'5