《干血斑中9種維生素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CAGRXXX-XXXX

干血斑中9種維生素的測定

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

determinationof9vitaminsindrieddloodspotusinghighperformanceliquidchromatographytandem

massspectrometry

（征求意見稿）

XXX-XX-XX發(fā)布XXX-XX-XX實(shí)施

中國老年保健醫(yī)學(xué)研究會(huì)發(fā)布

I

GB/XXXX—XXXX

干血斑中9種維生素的測定高效液相色譜-質(zhì)譜法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定干血斑中9種維生素（維生素

B1、維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B6、維生素B9、維生素A、維生

素D、維生素E）含量的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于干血斑中9種維生素含量的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅

所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包

括所有的修改單）適用于本文件。

BJS201716保健食品中9種水溶性維生素的測定

3原理

試樣經(jīng)手工或儀器提取后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，內(nèi)標(biāo)法校正，

同位素外標(biāo)法定量。

4試劑和材料

4.1試劑：甲醇（質(zhì)譜級(jí)）。

4.2甲酸（質(zhì)譜級(jí)）。

4.3七氟丁酸（質(zhì)譜級(jí)）。

4.4乙腈（質(zhì)譜級(jí)）。

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4.5異丙醇（質(zhì)譜級(jí)）。

4.6PBS（pH=7.4）。

4.7牛血清白蛋白（色譜分離，適用于細(xì)胞培養(yǎng)）。

4.8維生素標(biāo)準(zhǔn)品

各種維生素及對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、

相對(duì)分子量見下表。

相對(duì)分對(duì)應(yīng)維

中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式

子量生素

硫胺素Thiamine67-03-8C12H18Cl2N4337.2

Thiamine-(4-m維生素

1313

硫胺素C同C4C8H17Cl

13

ethyl-C-thiaz1257525-77-1341.2B1

位素N4OS·HCl

13

ol-5-yl-C3)

hydrochloride

核黃素Riboflavin83-88-5C17H20N4O6376.4

Riboflavin-(dio維生素

1315

核黃素CN83-88-5C13*C4H20N2

xopyrimidine-13382B2

同位素(unlabled)*N2O6

15

C4,N2)

煙酰胺Nicotinamide98-92-0C6H6N2O122.1

維生素

煙酰胺d4同Nicotinamide-2

B3

347841-88-7C6H2D4N2O126.6

位素,4,5,6-d4

4

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Pantothenic

泛酸599-54-2C9H17NO5219.2

acid

維生素

Vitamin[HOCH2C(CB5

泛酸C13N15同

B5(di-β-alaninN/AH3)2CH(OH)484.5

位素

13151513

e-C6,N2)CONH(C

13

calciumsaltH2)2CO2]2·

吡哆醛Pyridoxal65-23-6C8H11NO3167.1

維生素

吡哆醛d3同Pyridoxal-(metC8H6D3NO3

1173023-49-8170.2B6

位素hyl-d3)

葉酸Folicacid59-30-3C19H19N7O6441.4

維生素

Folic

13151315

葉酸CN同59-30-3C5C14H19

acid-(glutamic447.4B9

位素(unlabeled)NN6O6

1315

acid-C5,N)

視黃醇Retinol68-26-8C20H30O286.5

維生素

視黃醇d5同all-trans-Retino

1185244-58-9C??H??D?O291.48A

位素l-d5

25-羥基膽鈣25-Hydroxyvit維生素

19356-17-3C27H44O2400.6

化醇aminD3D

5

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25-羥基膽鈣25-Hydroxyvit

化醇d3同位aminD3N/AC27D3H41O2403.7

素(6,19,19-d3)

Alpha-tocopher

α-生育酚59-02-9C29H50O2430.7

ol維生素

α-Tocopherol

α-生育酚d6

E

(phenyl-5,7-di113892-08-3C29D6H44O2436.7

同位素

methyl-d6)

4.9除另外有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水

的要求。

4.10萃取液A：取5mL10%的甲酸水溶液，用甲醇定容到50mL。

4.11萃取液B：量取350mL甲醇及150mL水配成7:3(v/v)甲醇水溶液。

4.12液相流動(dòng)相A（0.1%甲酸0.05%七氟丁酸水溶液）：精密量取500μL甲

酸和250μL七氟丁酸至500mL容量瓶，用水定容。

4.13液相流動(dòng)相B：乙腈。

4.14模擬空白血漿配制

取2g牛血清白蛋白（BSA）溶解于約80mLPBS中，移至100mL容量瓶中，

用PBS定容，配成2%BSA-PBS溶液作為模擬空白血漿，保存于-20℃冰箱備用。

4.15維生素對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

硫胺素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取硫胺素標(biāo)準(zhǔn)品0.1g（精確至0.0001g），用0.1%

甲酸水溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。

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鹽酸吡哆醛、煙酰胺、泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取鹽酸吡哆醛、煙酰胺

和泛酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1g（精確至0.0001g），用水溶解并定容至100mL棕色容

量瓶中。

核黃素、葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取核黃素、葉酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1g（精確至0.0001

g），加入30mL氨水溶解，甲酸調(diào)節(jié)pH值至7.0后，用水轉(zhuǎn)移并定容至100mL

棕色容量瓶中。

維生素A、D、E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取視黃醇、25-羥基膽鈣化醇、α-

生育酚0.1g（精確至0.0001g），用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中。

4.16維生素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)液的配制

4.16.1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液

硫胺素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取硫胺素C13同位素標(biāo)準(zhǔn)品0.1g（精確至0.000

1g），用0.1%甲酸水溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。

吡哆醛、煙酰胺、泛酸內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取吡哆醛、煙酰胺和泛

酸內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品0.1g（精確至0.0001g），用水溶解并定容至100mL棕色容量瓶

中。

核黃素、葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取核黃素、葉酸內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品0.1g（精確至

0.0001g），加入30mL氨水溶解，甲酸調(diào)節(jié)pH值至7.0后，用水轉(zhuǎn)移并定容至

100mL棕色容量瓶中。

維生素A、D、E內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取視黃醇、25-羥基膽鈣化醇、

α-生育酚內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品0.1g（精確至0.0001g），用甲醇溶解并定容至100mL

棕色容量瓶中。

4.16.2內(nèi)標(biāo)液

取“4.16.1”下制得的內(nèi)標(biāo)母液，用水混合定容到25mL制得如下表濃度的

維生素內(nèi)標(biāo)混合溶液A，保存于-20℃冰箱備用。

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將內(nèi)標(biāo)液A稀釋5倍制得內(nèi)標(biāo)液B。

維生素B1內(nèi)標(biāo)25ng/mL

維生素B2內(nèi)標(biāo)100ng/mL

維生素B3內(nèi)標(biāo)1000ng/mL

維生素B5內(nèi)標(biāo)500ng/mL

維生素B6內(nèi)標(biāo)250ng/mL

維生素B9內(nèi)標(biāo)50ng/mL

維生素A內(nèi)標(biāo)1000ng/mL

維生素D內(nèi)標(biāo)150ng/mL

維生素E內(nèi)標(biāo)5μg/mL

4.17基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

取“4.15”項(xiàng)下維生素對(duì)照品母液，用模擬空白血漿稀釋制得如下表濃度混

合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線模擬血漿樣本。

維生素B11、2、5、15、20、25ng/mL

維生素B22、5、10、20、40、80ng/mL

維生素B3200、500、1000、2000、4000、8000ng/mL

維生素B550、100、150、200、400、800ng/mL

維生素B65、10、20、40、60、80、100ng/mL

維生素B91、2、5、10、15、20ng/mL

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維生素A50、100、150、200、400、800ng/mL

維生素D5、10、20、40、80、120ng/mL

維生素E0.2、0.5、1、2、4、8μg/mL

5儀器和設(shè)備

5.1液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）

5.2電子天平（感量0.01mg）

5.3干血斑全自動(dòng)萃取儀

6測定步驟

6.1試樣制備

用醫(yī)用酒精棉簽擦拭右手中指指尖采血部位，等酒精干燥。用微創(chuàng)采血

針壓于指腹采血，輕柔按壓手指創(chuàng)口朝下收集血液到血液收集管中，收集約

100μL血液，用移液槍移取指尖血20μL，滴于DBS卡印圈正中心。將干血斑

卡片放置于全自動(dòng)干血斑萃取儀室溫條件下（22-26℃）干燥3h后，轉(zhuǎn)移至密

封鋁箔袋中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

6.2樣品前處理（手工或使用全自動(dòng)萃取儀）

6.2.1向干血斑點(diǎn)均勻添加10μL內(nèi)標(biāo)液B（手工或使用全自動(dòng)干血斑萃取

儀），干燥30s；使用20μLDBS萃取液對(duì)干血斑進(jìn)行萃取，并將全部萃取液

B進(jìn)樣到LC-MS/MS（在使用手工萃取的情況下萃取液應(yīng)經(jīng)過0.22μm在線柱

前過濾器）。

6.3液相條件

6.3.1色譜柱：PhenomenexKinetex2.6μmPFP色譜柱（100×4.6mm）或同

9

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性能其他色譜柱

6.3.2流動(dòng)相A為0.1%甲酸0.05%七氟丁酸水溶液，B為乙腈，總流速為

0.7mL/min。流動(dòng)相梯度如下表：

時(shí)間（min）流動(dòng)相B（%）時(shí)間（min）流動(dòng)相B（%）

054.595

15895

3608.15

3.560105

6.3.3進(jìn)樣條件：柱溫箱溫度為40℃；從DBS進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20μL。

6.4參考質(zhì)譜條件

6.4.1離子源參數(shù)：

離子源電噴霧電離正離子模式（ESIpositive）

掃描模式多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）

氣簾氣(CUR)35Psi

碰撞氣（CAD)Medium

霧化氣（GS1）60Psi

輔助加熱氣（GS2）60Psi

溫度（TEM）650℃

離子噴霧電壓（IS）5500V

6.4.2質(zhì)譜參數(shù)

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每個(gè)離子對(duì)掃描時(shí)間為20ms，EP均設(shè)置為10，CXP均設(shè)置為10，其余

參數(shù)設(shè)置如下圖所示：

Q1mass

Q3mass（Da）DPCE

（Da）

定量離子12217

硫胺素26540

定性離子14414

硫胺素定量離子12223

C13同位26940

定性離子148.123

素

定量離子24334

核黃素37788

定性離子17252

核黃素定量離子24935

C13N1538390

定性離子17552

同位素

定量離子8024

煙酰胺123130

定性離子9622

煙酰胺定量離子8429

d4同位12790

定性離子10024

素

定量離子9019

泛酸22030

定性離子18421

泛酸定量離子9421

C13N1522440

定性離子18832

同位素

定量離子15015

吡哆醛16858

定性離子9432

吡哆醛定量離子15319

d3同位17165

定性離子9733

素

定量離子29522

葉酸44246

定性離子17653

葉酸定量離子29524

44860

C13N15定性離子34426

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同位素

定量離子9322

視黃醇26960

定性離子11925

視黃醇定量離子9321

d5同位274.250

定性離子12421

素

25-羥基定量離子25719

膽鈣化383.3115

定性離子15934

醇

25-羥基定量離子257.419

膽鈣化