液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定雜質(zhì)

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

目錄第一章:

基本原理第二章：質(zhì)譜在藥品雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用2第三章：質(zhì)譜在基因毒性雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用第一章:基本原理31.1

原子分子質(zhì)量1.2

離子源1.3

質(zhì)量分析器4JosephJohnThomson

1906NobelPrizeforPhysicsFrancisWilliamAston

1922NobelPrizeforChemistryWolfgangPaul

1989NobelPrizeforPhysicsJohnBennetFenn

2002NobelPrizeforChemistryKoichiTanaka

2002NobelPrizeforChemistry質(zhì)譜特殊的天平：稱量離子的質(zhì)量。

原子分子質(zhì)量MassSpectrometryisusedtodeterminethemassandstructureofmoleculesbasedonthemass-to-charge(m/z)ratioofthemolecularionanditsfragments.檢測(cè)對(duì)象：荷電粒子m/z=mass-to-chargeratio（荷質(zhì)比）=質(zhì)譜非光譜Spectroscopyn.光譜學(xué),波譜學(xué),光譜儀Spectrometry:SpectrometerAbbreviatedto:Massspec.orMS沒有光與波長(zhǎng)的概念7原子質(zhì)量原子構(gòu)成：質(zhì)子、中子和電子?中子=1.674928610-27kg?質(zhì)子=1.672623110-27kg?電子=9.109389710-31kg?中子=1?質(zhì)子=0.99862349?電子=0.00054386734?中子=939.56MeV?質(zhì)子=938.27MeV?電子=0.511MeVE=mc28原子質(zhì)量質(zhì)量單位：碳12元素原子質(zhì)量的1/12為一個(gè)原子質(zhì)量單位?中子=939.56MeV?質(zhì)子=938.27MeV?電子=0.511MeV9精確質(zhì)量AtomMassofAtom#ofAtomsSumHydrogen1.007834040.31300Carbon12.0000033396.00000Nitrogen14.00307228.00615Oxygen15.994929143.95424Total608.27338PlusH1.0078311.00783Total609.28121Minuse-0.0005510.00055609.28066Reserpine(C33H40N2O9)10分辨率半峰寬m1分辨率=m1/(Dm/z)Dm/zatFWHM精確質(zhì)量測(cè)定先決條件１）儀器具有足夠的分辨率２）被測(cè)峰具有足夠的峰強(qiáng)度11

四極桿離子阱TOF磁質(zhì)譜四極桿飛行時(shí)間Accuracy100ppm100ppm10ppm<5ppm<1ppm-2ppmResolution<4000<400020,00060,00020,000-40,000m/zRange<4000<400020,00010,00020,000TandemMSMS2(triplequad)MSnMS2MS2MS2分辨率12同位素（isotope）定義：具有相同質(zhì)子數(shù)，不同中子數(shù)的同一元素得不同核數(shù)自然界天然同位素準(zhǔn)分子離子質(zhì)子加和物：[M+H]+陽離子加和物：[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+二聚離子：[2M+H]+、[2M+Na]+準(zhǔn)分子離子去氫離子：[M-H]-陰離子加和物：[M+Cl]-二聚離子：[2M-H]-15[M+H]+:373[M+Na]+:39516[M+H]+:822[M+NH4]+:839[M+H]+:844[M+H]+:86017第一章:基本原理181.2

離子源離子源（接口）進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器19離子源（接口）電子轟擊EI

化學(xué)電離CI電噴霧電離ESI大氣壓化學(xué)電離APCI解吸附電噴霧DESI大氣壓分析探針ASAP20工作原理：

樣品溶液從毛細(xì)管流出時(shí)，在電場(chǎng)與輔助氣流的作用下噴成霧狀的液滴，在加熱氣體的作用下，液滴中溶劑被蒸發(fā)，使液滴直徑逐漸變小，因而表面的電荷密度增加，當(dāng)達(dá)到雷利極限時(shí)，即表面電荷產(chǎn)生的庫(kù)侖推斥力與液體表面張力相等時(shí)，則會(huì)發(fā)生“庫(kù)侖爆炸”，把液滴炸碎，產(chǎn)生帶電的更小液滴，此過程不斷重復(fù)，直到液滴變得足夠小，表面電荷形成的電場(chǎng)足夠強(qiáng)，最終把樣品離子從液滴中解吸出來，形成的樣品離子通過錐孔，聚焦透鏡等進(jìn)入質(zhì)譜分析系統(tǒng)。電噴霧離子源（ESI）22電噴霧離子源23大氣壓化學(xué)電離源(APCI)帶電荷溶劑離子+++++++++++++++++++++++蒸汽加熱+分析物離子電荷轉(zhuǎn)移++++其他新型離子源24第一章:基本原理251.3

質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器四極桿（Q）離子阱（IT）飛行時(shí)間（TOF）FTICROrbital-Trap空間串聯(lián)時(shí)間串聯(lián)IonPulserTurbo2Octopole1RoughPumpTurbo1Turbo1Turbo1QuadMassFilter(Q1)CollisionCellLens1and2HiSpeedDetectorAssemblyIonBeamCompressor*Hi-ResSlicerAssemblyTurbo2IonMirrorAssemblyFlightAssemblyCollisionCellTurbo2Turbo127空間串聯(lián)時(shí)間串聯(lián)28離子阱質(zhì)譜全掃描圖譜分析質(zhì)量數(shù)選擇碰撞誘導(dǎo)解離（CID）檢測(cè)器檢測(cè)IT-TOF

離子源離子傳輸部分質(zhì)量分析器檢測(cè)器3DIontrapTimeofFlight目錄第二章：質(zhì)譜在藥品雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用3031雜質(zhì)譜雜質(zhì)：任何影響藥品純度的物質(zhì)（中國(guó)藥典）Impurity:anycomponentofasubstanceforpharmaceuticalusethatisnotthechemicalentitydefinedasthesubstance（EP）ICH相關(guān)限度32MaximumDailyDoseReportingThresholdIdentificationThresholdQualificationThreshold≤2g/day0.05%0.10%or1.0mgperdayintake(whicheverislower)0.15%or1.0mgperdayintake(whicheverislower)>2g/day0.03%0.05%0.05%液質(zhì)聯(lián)用鑒定雜質(zhì)33應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用:電噴霧質(zhì)譜:與液相高流速兼容LC-UV:純度測(cè)定MS:推測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)Templatestructureidentificationmethod:Template:maincomponentfragmentationfeaturesStudyfragmentationroutesofunknownpeaksProposethestructurebasedontemplate34HPLC方法質(zhì)譜兼容HPLCESI-ITMSESI-QTOFMS碎片裂解途徑解析元素組成制備液相色譜/合成1D,2DNMR目標(biāo)化合物形成過程芐達(dá)賴氨酸芐達(dá)酸和賴氨酸復(fù)鹽醛還原酶抑制劑預(yù)防、延緩白內(nèi)障藥物HPLC：ShimadzuLC-20AT型高效液相色譜儀色譜柱：Kromasil100-5C18柱（250mm×4.6mm，5μm）流動(dòng)相：0.1%乙酸-乙腈（57：43）流速：1.0ml/min柱溫：30℃波長(zhǎng)：

227nm質(zhì)譜儀：Agilent6538四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀離子源：電噴霧離子源電壓：4000V干燥氣：11L/min霧化氣：35psi毛細(xì)管溫度：325℃掃描范圍：50-1000芐達(dá)賴氨酸芐達(dá)賴氨酸227nm302nmImpurity1：0.19%Impurity2：0.29%Impurity3：0.10%123bendazac中國(guó)藥典芐達(dá)賴氨酸芐達(dá)酸雜質(zhì)1雜質(zhì)2雜質(zhì)3芐達(dá)酸雜質(zhì)1雜質(zhì)2雜質(zhì)3負(fù)離子圖譜芐達(dá)酸裂解機(jī)理雜質(zhì)3表1負(fù)離子模式下二級(jí)質(zhì)譜圖中主要的碎片離子峰理論值與實(shí)驗(yàn)值的偏差計(jì)算Tab.1SummaryofMS2resultsforimpuritiesinnegativemode母離子子離子實(shí)驗(yàn)值計(jì)算值分子式偏差

(ppm)371(impurity3)－371.1408371.1401C23H19N2O3-1.9327327.1499327.1503C22H19N2O--1.2313313.1351313.1346C21H17N2O-1.6298298.1236298.1237C21H16NO--0.3249249.1032249.1033C16H13N2O--0.4235235.0876235.0877C15H11N2O--0.4192192.0826192.0819C14H10N-3.6雜質(zhì)結(jié)構(gòu)雜質(zhì)3核磁共振（600MHz1HNMR，150MHz13CNMR）半制備液相（Shimadzusemi-preparativeHPLC）色譜柱：AgilentPrep-C18column(30mm×250mm,10um)流動(dòng)相：0.1%乙酸-乙腈（57：43）流速：1.0ml/min柱溫：30℃波長(zhǎng)：227nm雜質(zhì)3NMR1HNMR13CNMR雜質(zhì)3HMBC芐達(dá)賴氨酸合成工藝雜質(zhì)3形成過程色甘酸鈉系列液相色譜條件開發(fā)：原料、滴眼液均適用強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)：系統(tǒng)耐用性、強(qiáng)制降解路徑鑒定9個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中有2個(gè)未知雜質(zhì)，6個(gè)未知降解產(chǎn)物色甘酸鈉抗過敏藥，用于治療過敏性哮喘，療效較好歐洲藥典方法:色譜柱:SymmetryshieldC184.6*150mm,3.5um流動(dòng)相A:乙腈-10g/l四丁基硫酸氫銨(5:95)流動(dòng)相B:乙腈-10g/l四丁基硫酸氫銨(50:50)檢測(cè)波長(zhǎng):330nm梯度洗脫方法:0-15min:0%-100%15-20min:100%新開發(fā)方法:色譜柱:SunfireC184.6*150mm,3.5um流動(dòng)相A:10mM甲酸銨流動(dòng)相B:乙腈檢測(cè)波長(zhǎng):254nm梯度洗脫方法:0-30min:3%-50%35min:50%四丁基硫酸氫銨：離子對(duì)試劑色甘酸鈉歐洲藥典對(duì)照品原料藥滴眼液防腐劑色甘酸鈉熱破壞堿破壞氧化破壞色甘酸鈉EP對(duì)照品原料藥滴眼液Impurity1Impurity2Impurity3防腐劑Cromoglycate:469Impurity1:469Impurity2:731(468+263)Impurity3:415雜質(zhì)2元素組成:C36H27O16雜質(zhì)2雜質(zhì)361DegradationProducts光破壞堿破壞氧化破壞62降解產(chǎn)物63降解產(chǎn)物64PrecursorionsProductionsMeasuredmassCalculatedmassFormulaError(ppm)469(cromoglycate)－469.0757469.0765C23H17O11+-1.7451451.0654451.0660C23H15O10+-1.3263263.0549263.0550C13H11O6+-0.4245245.0443245.0444C13H9O5+-0.4207207.0286207.0288C10H7O5+-1.0469(impurity1)－469.0774469.0765C23H17O11+1.9451451.0677451.0660C23H15O10+3.8423423.0736423.0711C22H15O9+5.9263263.0565263.0550C13H11O6+5.7245245.0461245.0444C13H9O5+6.9207207.0284207.0288C10H7O5+-1.9高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)65降解路徑雜質(zhì)來源目錄67第三章：質(zhì)譜在基因毒性雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用GenotoxicimpurityRegulatoryToxicologyandPharmacology44(2006)198–211GenotoxicimpurityRegulatoryToxicologyandPharmacology44(2006)198–211達(dá)比加群酯DB-10ATTCvalue:1.5μg/dayintakeMaximum：300mg/day5.0μg/gGenotoxicimpurity島津LC-30AD超高效液相色譜儀；島津LCMS-8050三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀島津液質(zhì)聯(lián)用儀控制軟件為L(zhǎng)abSolutions5.72色譜柱：島津Shim-PackGISC18（2.1x50mm，2μm）流速：0.4ml/min，柱溫：40℃PDA檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）070301.570302.010907.010907.1703010.07030UPLC梯度洗脫表接口HV：4.0kV（正離子模式），-3.0kV（負(fù)離子模式）InterfaceTemperature：350℃DLTemperature：250℃HeatingBlockTemperature：350℃NebulizingGasFlow：2.5L/minHeatingGasFlow：12L/minDryingGasFlow：8L/minDwellTime：60msGenotoxicimpurityGenotoxicimpurity圖8.溴乙酸、對(duì)氨基苯腈、DB-10混合對(duì)照色譜圖Genotoxicimpurity對(duì)氨基苯腈Y=1499.93X+491.612（r2=0.9999）線性范圍為0.4-40ng/ml溴乙酸Y=476.807X+1051.52（r