酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的程序

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的程序第一節(jié) 間接ELISA試驗(yàn)一用可溶性抗原的ELISA：1、 純化抗原：用包被液稀釋至1—20ug/ml；2、 以50—100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中；3、 置4（度）過(guò)夜或37（度）吸附3h；4、 PBST洗三次；5、 每孔200ulPBS/NCS4（度）過(guò)夜封閉或37（度）封閉3h；6、 PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或許（度）保存?zhèn)溆茫?、 每孔加50—100ul第一抗體，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。若雜交瘤篩選，每孔加雜交瘤培養(yǎng)上清；8、 37（度）孵育2h9、 PBST洗5次，每次5min10、 每孔加50—100ul酶標(biāo)第二抗體；若雜交瘤篩選，每孔加HRP標(biāo)記的抗小鼠（IgG+IgM）抗體；11、 37（度）孵育2h12、 PBST洗5次，每次數(shù)5分鐘；13、 每孔加OPD或TMBS底物100ul14、 37（度）避光作用；（OPD為10—20）分鐘，TMBS為40分鐘）；15以50ul2MH2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值（OPD底物選用490nm濾光片，TMBS底物選用450nm濾:光片）；16結(jié)果判定：（1）P/N≥2.1為陽(yáng)性(2)P≥N+3SD為陽(yáng)性成功范例:NDV單抗檢測(cè)，粘附素單抗檢測(cè)，H單抗檢測(cè)亞類鑒定和雞白痢檢疫等。二、用全菌抗原的ELISA法（一） GA法1、 新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水懸浮，光密度法或比濁法調(diào)整細(xì)菌濃度至1X10（6）個(gè)/ml。注意：沙門氏菌等人畜共患病原體，使用前必須滅活或采用市售的滅活診斷菌液；2、 酶標(biāo)板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1MNaHCO495ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小時(shí)3、 蒸餾水洗5次;4、 加細(xì)菌懸浮液,50ul/孔;5、 37(度)溫箱內(nèi)過(guò)液,干燥吸附(20—24h)6、 加PBS/NCS220ul/孔37（度）封閉3小時(shí)或4（度）過(guò)夜封閉；7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放備用；8、 以下步驟同一。（二） MA法1、 細(xì)菌懸液（1X10（6））50ul/孔；2、 室溫或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室溫10分鐘；3、 加PBS/NCS封閉，37（度）3小時(shí)或4（度）過(guò)夜；4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存?zhèn)溆茫?、 以下步驟同一成功范例：H單抗檢測(cè)等。三、用全細(xì)胞抗原的ELISA1、 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液；2、 加100ul/孔細(xì)胞懸殊浮液于酶標(biāo)板內(nèi)，使每孔含細(xì)胞5X10（）3、 將板離心1000rpm10分鐘，甩去上清，室溫干燥（可保存在4℃或—20℃?zhèn)溆茫?、 PBST冼3次，每次5分鐘；5、 每孔加100ul第一抗體或雜交瘤上清，設(shè)立對(duì)照；6、 37℃1—2小時(shí)；7、 PBST洗3次；8、 每孔加入100ul酶標(biāo)第二抗體，37℃1—2小時(shí)；9、 PBST冼5次；10、 每孔加入100ul底綬沖液，室溫作用30分鐘；11、 判定結(jié)果。成功范例：粘附素單抗，O抗原單抗檢測(cè)等。注意：若需要，可滅活細(xì)胞內(nèi)源酶，以減少本底反應(yīng)。其它方法參見本章第六節(jié)。第二節(jié) 直接ELISA1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方陣試驗(yàn)確定）包被標(biāo)板（50—100ul/孔）；2、PBS/NCS封閉板（保存?zhèn)溆茫?、 每孔加50—100ul酶標(biāo)抗菌素體；設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照；4、 37℃孵育2h5、 PBST洗5次，每次5分鐘；6、 以下同間接ELISA；成功范例：沙門氏菌檢驗(yàn)、抗血清效價(jià)測(cè)定、酶標(biāo)抗體效價(jià)測(cè)定等。第三節(jié) 夾心ELISA試驗(yàn)1、 單一或混合單抗腹水或純化的免疫血清用包被液稀釋后25—100ug/ml；（有人使用蒸餾水直接稀釋腹水作包被）。2、 以50—100ul/孔量加入酶標(biāo)板中；3、 置4℃過(guò)夜吸附或37℃吸附3h4、 PBST洗3次；5、 PBS/NCS封閉，200ul/孔，4℃過(guò)夜或37℃3h；6、 PBST洗滌5次，每次1min；（可于—20℃保存?zhèn)溆茫?、 每孔加50—100ul待檢抗原，同時(shí)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照；8、 37℃孵育2h；9、 PBST洗5次，每次5min；10、 每孔加50—100ul酶標(biāo)單抗或酶標(biāo)純化抗體；11、 37℃孵育2h；12、 PBST洗5次，每次5分鐘；13、 37℃孵育2h14、 PBST洗5次，每次5min；15、以下步驟同前。成功范例：雞新城疫病毒，大腸桿菌，沙門氏菌檢測(cè)。第四節(jié) 競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)1可溶性抗原以包被液稀釋至1ug/ml（需方陣滴定確定），（全菌抗原包被方法參見前述）；2、50—100ul/孔，包被酶標(biāo)扳；3、4℃過(guò)夜吸附；4、PBST洗3次。每次5分鐘；5、PBS/NCS封閉200ul/孔，37℃3hr或4℃（保存?zhèn)溆茫?、PBST洗3次，每次5分鐘（可—20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?、 加50—100ul/孔待檢血清樣品，再加入50—100ul/孔單抗，設(shè)立對(duì)照；8、 37℃孵育1—2h；9、 PBST洗5次，每次5分鐘；10、 每孔加OPD50—100ul；11、 37℃避光作用10—20min；12、 以100ul/孔加2MH2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定OD490；13、 判定結(jié)果：（1） 抑制率（N—P/N）》50%判為陽(yáng)性；（2） OD490值《NCXⅩ0.3+PCXX0.7為陽(yáng)性(PCX為陽(yáng)性對(duì)照的平均值,NCX為陰性對(duì)照的平均值)。成功范例：檢測(cè)傷寒、雞白痢抗體等。第五節(jié) Dot—ELISA1、 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求不同，選用硝酸纖維膜，混合膜或醋酸膜，并切成條帶，以硬模壓痕跡；2、 以蒸餾水或TBS浸泡膜條帶，取出晾干后備用；3、 抗原包被：（1）、可溶性抗原（ug/ul），每點(diǎn)點(diǎn)加5ul，37℃烘干；（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每點(diǎn)點(diǎn)加5ul；37℃烘干，可先將條帶經(jīng)5%GA處理后，37℃3h或4℃過(guò)夜，再加樣烘干。4、 TBS/NCS或BSA封閉；5、 漂洗；6、 將膜轉(zhuǎn)入酶標(biāo)抗體內(nèi)，37℃0.5-2h;(間接法步驟是:先于第一抗體中浸染漂洗后，轉(zhuǎn)入酶標(biāo)第二抗體中反應(yīng))。7、 漂洗；8、 把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中顯色，室溫10—30分鐘；9、 漂洗；10、 晾干后，判讀結(jié)果（可以進(jìn)行掃描分析）。成功范例：脂多糖抗原檢測(cè)，大腸桿菌檢測(cè)，單克隆抗菌素體篩選等。第六節(jié) 酶標(biāo)組化法1、 抗原準(zhǔn)備：（1） 細(xì)胞涂片：（2） 病變組織觸片或冰凍切片；（3） 生長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)孔或玻片；2、 4℃丙酮固定10分鐘；3、 滅活內(nèi)源酶：將待檢玻片浸入內(nèi)源酶滅活液內(nèi)，或于培養(yǎng)孔內(nèi)加入內(nèi)源酶滅活液，室溫滅活30分鐘，棄去滅活液，以PBS和去離子水充分洗滌10—20分鐘，自然干燥；4、 以PBS/NCS封閉，37℃2小時(shí)或4℃過(guò)夜；5、 酶染：加酶標(biāo)抗體反應(yīng)（或間接法步驟進(jìn)行）37℃1—2小時(shí)，并設(shè)立對(duì)照；6、 PBS洗15分鐘表；7、 以DAB顯色，室溫避光30分鐘；8、 鏡檢：細(xì)胞漿呈棕黃色，細(xì)胞核無(wú)色，陰性對(duì)照無(wú)色，判為陽(yáng)性。（4—氯—1—萘酚顯色）。成功范例：豬瘟組化法診斷。第七節(jié) ELISA常用溶液的配方一、 包被液1、 碳酸鹽綬沖液0.2MNa2CO3:12g無(wú)水Na2CO3+100ml去離子水0.2MNaHCO3：1.68gNaHCO3+100ml去離子水取0.2MNaCO3：8ml，0.2MNaHCO3:17ml混合再加75ml去離子水,調(diào)PH至9.6。2、 Tris—HCL綬沖液（PH6.0,0.02M）0.1NTris100mｌ0.1NHCL58.4ml培養(yǎng)離子水加至1000ml(TrisMW121.14)3、 其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，請(qǐng)參閱有親章節(jié)和文獻(xiàn)。二、稀釋和封閉液1、 EPBA（PH7.2）NaCL80gNa2HPO4.12H2O14.5gKCL2gKH2PO42g去離子水10升2、 EPBS/Tween—20/NCS：EPBS+0.05%Tween—20+10%NCSor！%BSA3、Tris—HCL綬沖液PH7.00.01M0.1MTris50.0ml0.1NHCL46.5mlNaCL8.5gBSA50g正常山羊血清150ml檬酸:去離子水1000ml三、洗滌液1、 EPBS/Tween—20EPBS+0.05%Tween—20（或80）2、 Tris—HCL/TweenPH7.40.02M1.0MTris20ml1.0NHCL15ml1.0NHCL15ml調(diào)PH至7.4Tween—2.00.5mlDW加至于1000ml四、底物溶液1、 磷酸鹽—檸檬酸綬沖液（NO.1）0.1M檸檬酸:10.5gC6H6O7.H2O+DDW500ml0.2MNa2HPO4.12H2O+DDW1000ml取24.3ml0.1M檸檬酸、25、7ml0.2MNaHPO4再加50mlDDW注:檸檬酸溶液及配成的底物綬沖液不穩(wěn)定,易形成沉淀,因此一次不宜配制過(guò)多。2、 OPD（鄰苯二胺）底物NO.1底物綬沖液10mlOPD4mg3%H2O240ul3、 TMBS（四甲聯(lián)苯胺硫酸鹽）TMBS貯液：10mg/mlDMSO4℃避光存放。TMBS貯液100ulNO.1底物綬沖液10ml1%H2O225ul4、0.05MPH7.6Tris_—HCL緩沖液0.1MTris50ml0.1NHCL38.5mlDW至100ml5、TBSbuffer（NO.220MmTrisbase500MmNacLadjustedtoPH7.5WithHCL6、 DAB（二氧基苯胺鹽酸）底物DAB75mgNO.2底物綬沖液100ml避光攪拌3小時(shí),使其溶解,濾紙過(guò)濾.臨用前加1%H2O20.5ml7、4—氯—1—萘酚底物（4CN） (1)4CN貯液：3mg4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；(2)使用液：2ml4CN貯液+10mlTSbuffer+H2O2至0.01%(V/V)7、 酶反應(yīng)終止液2mH2SO4濃H2SO410ml溶于80mlDW六、內(nèi)源酶滅活液：0.01%H2O2,NaN,PH7.60.05MTris—HCL綬沖液：取PH7.50.05MTris—HCL綬沖液98ml，加1%H2O21ml1%NaN1ml即成。第八節(jié) 酶標(biāo)抗體的制備一、 1、試劑1、 0.1MNaHCO3：0.84gNaHCO3+DDW100ml2、 0.1MNa2CO3：1.06gNa2CO3-DDW100ml3、 EPBS：同第七節(jié)4、 10mMNaIO4204.0mgNaIO4+DDW100ml5、 0.1mMNaOH6、 5mg/mlNaBH4：0.1gNaBH4+0.1mMNaOH20ml二、 HRP直接標(biāo)記腹水中單抗1、 5mgHRP溶于0.5ml0.1MNaHCO32、 加0.5ml10mMNaIO4，混勻，蓋緊瓶塞3、 室溫（20℃）避光作用2h4、 加0.75ml0.1MNaCO3，混勻5、 加0.75ml小鼠腹水，混勻6、 用少許PBS將交聯(lián)物轉(zhuǎn)移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中7、 加SephadexG15或50干粉0.5g，混勻。蓋緊，室溫作用（避光）3h8、 用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出9、 收集洗出液，加1/20V新鮮配置的5mg/mlNaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘10、 再加3/20VNaBH4溶液，混勻，室溫作用1h或4℃過(guò)夜11、 將交聯(lián)物過(guò)SephdexG200或Sepharose6B（2.5*50cm）層析純化，分管收集第一峰12、 酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：（1） 克分子比值測(cè)定酶量（mg/ml）=OD403*0.4Ig量（mg/ml）=（OD280-OD403*0.3）*0.62酶結(jié)合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量標(biāo)記率=OD403/OD280E/P值為1-2之間合格（2） 特異性及效價(jià)