2024牡蠣徐氏擬裸莖吸蟲熒光定量 PCR 檢測方法

PCR 范 縮略 試 樣 結(jié)果判 安 附 本文件適用于牡蠣科寄生徐氏擬裸莖吸蟲的檢測GB/T6682GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T1193基因分析檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范COIc氧化酶第一亞基（CytochromecoxidasesubunitDEPC：焦炭酸二乙酯（DiethylCt值：循環(huán)閾值（CyclethresholdEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerasechainTAE：Tris、乙酸（Aceticacid）和EDTAEB：溴化乙錠（EthidiumGB/T668250×TAEA.1.110A.1.2μg/μLRNaseA.2.275%A.2.3PCRSYBRGreenPremixExTaqIITaqDNA聚合U/μLmmol/LdGTPSYBRμMμM引物COI-QF：GGTTGATGTTAAGACTTCGG，-20℃DNA2×PremixTaqDNA聚合酶：生化試劑，-20℃95℃rpm300V1.5mL200μLPCR反應(yīng)管（A.2.1處理，或其它等效產(chǎn)品RNase的微量加樣0.001g、組織研磨器、離心機(jī)（12000rpm、微波爐。SC/T71034℃低溫環(huán)境下離水運(yùn)輸，用濕毛巾覆蓋。實(shí)驗(yàn)室接到牡蠣樣品后將貝殼表RNase2mL凍存管中，液氮冷凍。100mg1.5mLRNase1mLTRIzol5min200μL15sec5min12000rpm4℃15min1.5mLRNaseμL12000rpm4℃10min，棄去上清，RNA1mL75%乙醇，輕輕顛倒洗滌沉淀，7500g4℃5minRNA5min～10min30μL~250μLRNaseRNA表 10μL5×PrimeScript2PrimeScriptRTEnzymeMix0.5OligodTPrimer（500.525Random6mers（1000.525500RNaseFree補(bǔ)至105sec；4℃加入40μL～90μL表 20μL2×PermixTaqDNA10檢測引物COI-qF（1021檢測引物COI-qR（10212補(bǔ)至201×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。9μLPCR1μL10DNA分子120V30min~40min表 20μLSYBRGreenPremixExTaq10檢測引物COI-qF（1010.5檢測引物COI-qR（1010.52補(bǔ)至20PCRPCRPCR儀，按照以下反應(yīng)參數(shù)設(shè)置并運(yùn)行儀器：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec，40個循環(huán)。PCR（SYBR法）陰性對照無Ct值或Ct值≥33，且無特異性擴(kuò)增曲線；陽性對照Ct值＜30，實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)按GB/T19489檢測過程中防污染措施按照SN/T1193 錄0.5mol/LEDTA-Na2溶液，pH 186.1滅菌去離子 8005mol/L氫氧化鈉溶 調(diào)pH至1000mL，121℃，15min 242冰乙 57.10.5mol/LEDTA溶液，pH8.0 100mL滅菌去離子水加至1000mL，121℃，15min滅菌備用。用時(shí)用滅菌去離子水稀釋至1×使用。聚蔗 25滅菌去離子 100溴酚 0.1EB（10溴化乙 20滅菌去離子 20.5μg/mL2.5%瓊脂 2.5 100,50℃~55℃EB（10μgμL）5μL輕輕晃min，取RNaseRNase加樣器吸頭等塑料用具應(yīng)無RNase。操作過程中應(yīng)自始至終戴一次性橡膠或乳