T-QGCML 4275-2024 肉松食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的測定

ICS07.100.30CCSC53肉松食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的測定DeterminationofListeriamonocytogenesinmeatfloppingsIT/QGCML4275—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4設(shè)備和材料 5培養(yǎng)基和試劑 6檢驗(yàn)方法 27操作步驟 28結(jié)果報(bào)告 3T/QGCML4275—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由運(yùn)城市綜合檢驗(yàn)檢測中心提出。本文件由全國城市工業(yè)品貿(mào)易中心聯(lián)合會歸口。本文件起草單位：運(yùn)城市綜合檢驗(yàn)檢測中心、運(yùn)城市市場監(jiān)管綜合行政執(zhí)法隊(duì)、山西大學(xué)、玖零零幺質(zhì)量研究院（山西）有限公司。本文件主要起草人：韓珍珍、竇夢璇、曹本男、王彬、王彪、師娟、薄濤、李宣英。本文件為首次發(fā)布。1T/QGCML4275—2024肉松食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的測定本文件規(guī)定了肉松食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌測定的設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑、檢驗(yàn)方法、操作步驟和結(jié)果報(bào)告。本文件適用于肉松食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.30—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4設(shè)備和材料4.1從各超市抽取零售散裝的豬肉松、雞肉松、牛肉松共167份，所有樣品均用無菌采樣袋密封包裝。4.2除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：a)生物安全柜；b)生化培養(yǎng)箱；c)均質(zhì)器；d)顯微鏡帶照相系統(tǒng)，10倍～100倍（油鏡）；e)濁度儀；f)全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)；g)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC19114或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；h)金黃色葡萄球菌（ATCC6538或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；i)馬紅球菌（ATCC6939或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；j)英諾克李斯特氏菌（ATCC33090或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；k)伊氏李斯特氏菌（ATCC19119或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；l)斯氏李斯特氏菌（ATCC35967或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）。5培養(yǎng)基和試劑測定過程中使用的培養(yǎng)基和試劑如下：a)李氏增菌肉湯LB（LB1、LB2b)PALCAM瓊脂；d)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒；2T/QGCML4275—2024e)李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基；f)GP鑒定卡。6檢驗(yàn)方法6.1.1按GB4789.30—2016規(guī)定的方法進(jìn)行。共取樣品n=5進(jìn)行檢驗(yàn)，依次編號為01～05，共5組，每組做2個(gè)平行，步驟依次為增菌、分離、初篩、鑒定和計(jì)數(shù)。6.1.2檢測前應(yīng)對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境及關(guān)鍵培養(yǎng)基及菌種進(jìn)行驗(yàn)證，確保試驗(yàn)準(zhǔn)確。7操作步驟7.1增菌以無菌操作取樣品25g（mL）放入含有225mLLB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mLLB2增菌液的均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min。于（30±1）℃培養(yǎng)（24±1）h，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLLB2增菌液內(nèi)，于（30±1）℃培養(yǎng)（24±1）h。7.2分離取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24h～48h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說明進(jìn)行判定。7.3初篩自選擇性瓊脂平板上分別挑取獨(dú)立區(qū)域的3個(gè)～5個(gè)典型或可疑菌落（可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)排除部分藍(lán)綠色菌落，如周圍無暈圈的藍(lán)綠色小菌落分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±1）h，同時(shí)在TSA-YE平板上劃線，于（36±1）℃培養(yǎng)18h～24h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。7.4鑒定7.4.1溶血試驗(yàn)將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20個(gè)～25個(gè)小格，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽性對照菌（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），穿刺時(shí)應(yīng)接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂。于（36±1）℃培養(yǎng)24h～48h，于明亮處觀察，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈現(xiàn)窄清晰明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h～48h再觀察。7.4.2協(xié)同溶血試驗(yàn)在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不應(yīng)觸及平行線，距離1mm～2mm，同時(shí)接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，于（36±1）℃培養(yǎng)24h～48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約2mm的β-溶血增強(qiáng)區(qū)域，斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強(qiáng)區(qū)域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約5mm～10mm的“箭頭狀”3T/QGCML4275—2024β-溶血增強(qiáng)區(qū)域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h～48h再觀察。7.4.3生化試劑盒及全自動生化鑒定儀鑒定從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取目標(biāo)菌落，先利用濁度