DB12T 839-2018 茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法　

2018-11-07發(fā)布2018-12-01實施I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、王利英、趙新、王成、蘭璞、喬軍、劉婧、陳銳、關(guān)海濤、張耀中、焦賀敏。1準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義由幾個核苷酸(1～6個)為重復(fù)單位聚集而成的長達(dá)幾十個至幾百個bp(一般為100～200)的串聯(lián)4原理2PCR儀；測序電泳槽；水平電泳槽；高壓電泳儀(3000V,400mA,400W);萬分之一電子天平；微量加樣器；磁力攪拌器；臺式離心機(jī)；紫外-可見成像系統(tǒng)；膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2);三羥甲基氨基甲烷(Tris);鹽酸(HC1,36%);十二烷基硫酸雙丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；親和硅烷；剝離硅烷；無水乙醇；四甲基乙二胺(TEMED);過硫酸銨；冰醋酸；硝酸銀；甲醛溶液(37%);TaqDNA聚合酶(含Mg2的10×PCR緩沖液);四種脫氧核糖核苷酸 水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水等。除特殊說明外，所用試劑6方法步驟6.1取樣覆蓋一層紗布，置于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為16h35℃光照培養(yǎng)，8h28℃暗培養(yǎng)，待6.2.2DNA提取到65℃,每管放入400μL混合樣品，將離心管置于65℃金屬浴或水浴鍋中，保溫30min后取下，向入另一支1.5mL離心管，加入400μL-20℃預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA。10000g離心1min,棄上清液，36.4PCR擴(kuò)增6.4.1反應(yīng)體系總體積10μL,包括5μL超純水、1μL含Mg2的10×PCR緩沖液、0.8μLdNTPs(2.5mmol/L)、0.6μLSSR引物(10μmol/L)、1μLTaqDNA聚合酶(2.5U/μL)、1μLDNA(30～50ng/μL),94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,55℃退火30s,72℃延伸1min,循環(huán)35次；72℃延伸10min;-20℃保存?zhèn)溆谩?純度計算4(規(guī)范性附錄)含有200mmol/LTris-HCl(pH8.0),250mmol/LNaCl,25mmol/LA.2引物稀釋按照引物合成單的說明先配制100μmol/L的儲存液，取適量儲存液稀釋40倍，配制濃度為2.5去離子甲酰胺49mL,0.5mol/L的EDTA溶液(pH8.0)1mL,溴酚藍(lán)0.125g,二甲苯青0.125g。Tris108g,硼酸55g,0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液37mL,定容至1000mL。丙烯酰胺190g,甲叉雙丙烯酰胺10g,定容至500mL。尿素450g,10×電泳緩沖液100mL,40%丙烯酰胺膠112.5mL,定容至1000mL。20μL親和硅烷，20μL冰醋酸，加無水乙醇至2mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。5A.10固定液200mL冰醋酸，定容至2000mL。A.11染色液4g硝酸銀，定容至2000mL。A.12顯影液2000mL蒸餾水中加入40g氫氧化鈉和10mL甲醛。6(規(guī)范性附錄)15對核心引物序號引物引物序列(5'—3')退火溫度℃1F:GGATCAACTGAAGAGCTGR:CAGAGCTTCAATGTTCCA2F:ACGTCTCATCCGAAATATAAR:GTTTGATAAGAAGGGCAAG3F:ACAAGACGAAAGTGTGCAR:GTTTGAAAGTGAAGAGTC4F:ATGTTCTTCCCTTTTTCCR:GTTTCCAAGAAAGAAGAAA5F:ATCAAGATGAACAAGACTAAGR:GTTTCTTCAACCTGTCTT6F:ATCATTGCCGTATCAGGTR:GTTTGGGAAAGTTGAGAATTT7F:ACAGGCATCACAAAGCAT8F:ACAACATTTCTAAGGGCCR:GTTTGGGCATATTTGGCACTT9F:ATTTACTATGCTACTTCACAR:GTTTACTGATCGCAGGAAAAF:ATGTGTGAACTCAAATGGR:GTTTCGAATTGCTTTTTGGTGF:ATTGGTGAACGATGATCCR:GTTTAGAGAATGGGATGAGAF:ATTGACGGTGGAAAAGGAR:GTTTGGCGGCTTGATGATTTAF:ATCAAATGGGAGAAAATACR:GTTTGGCTTAAACACACAACGTAF:ACCTTACGCAATTTACACR:GTTTCAATGGCGTCACCTF:AGTGCATTTCTCAAATCAR:GTTTCAATTTCACAGGCTC7(規(guī)范性附錄)C.1凝膠制作膠80mL,加入TEMED80μL和10%過硫酸銨400μL,迅速混勻后灌膠。灌膠過程中防止氣泡產(chǎn)生。灌C.2預(yù)電泳在20μLPCR產(chǎn)物中加入4μL6×變性上樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運行變性程序：95℃變C.4電泳至上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板的中部。C.5銀染電泳結(jié)