第十章親和色譜

章親和色譜

2021/6/271生物分離過程的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性2021/6/272一、概述生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合，生物分子間的這種特異性相互作用稱為親和作用。生物分子間的親和識(shí)別包括抗體-抗原、酶-底物、激素-受體等親和作用。2021/6/273具有親和作用的分子對(duì)之間具有“鑰匙”和“鎖孔”的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系。親和結(jié)合作用，至少存在3個(gè)對(duì)應(yīng)官能團(tuán)相結(jié)合：靜電作用氫鍵疏水相互作用配位鍵弱共價(jià)鍵2021/6/2741、離子強(qiáng)度：一般來(lái)說(shuō)，提高離子強(qiáng)度，親和作用減弱或完成破壞。2、pH：在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，親和作用減弱或完成破壞。3、抑制氫鍵形成的物質(zhì)：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用影響親和作用的因素2021/6/2754、溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；但是，疏水性相互作用增強(qiáng)5、液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱6、螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失2021/6/276利用生物分子之間的專一性識(shí)別或特定的相互作用進(jìn)行分離的技術(shù)為親和分離技術(shù)親和配基是對(duì)生物分子具有專一性識(shí)別或特定的相互作用的物質(zhì)2021/6/277常見親合作用體系特異性親和體系高特異性抗原-單克隆抗體荷爾蒙－受體蛋白核酸－互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白酶－底物、產(chǎn)物、抑制劑群特異性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－輔酶凝集素－糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體酶、蛋白質(zhì)-肝素酶、蛋白質(zhì)-活性色素（染料）酶、蛋白質(zhì)-過渡金屬離子（銅、鋅等）酶、蛋白質(zhì)－氨基酸（組氨酸等）2021/6/2782021/6/27910找與底物專一可逆結(jié)合的配基；將配基通過共價(jià)鍵偶聯(lián)到基質(zhì)；配基與底物吸附；洗脫目標(biāo)物。

親和層析過程2021/6/271011二、親和純化技術(shù)親和層析(Affinitychromatography)親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團(tuán)萃取（反膠團(tuán)萃?。┯H和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）2021/6/27112021/6/2712配基生物特異性配基擬生物親和配基親和配基必須具備的條件：1、專一性識(shí)別或特異性作用必須是可逆的2、結(jié)合常數(shù)要適當(dāng)3、穩(wěn)定性好，可進(jìn)行化學(xué)改性2021/6/2713專一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度相互作用的強(qiáng)弱決定著吸附和解吸的難易程度2021/6/2714親和配基的分類單專一性的小分子配基基團(tuán)專一性的小分子親和配基專一性的大分子親和配基免疫親和配基基團(tuán)專一性的大分子親和配基2021/6/2715親和配基的選擇組合化學(xué)肽庫(kù)選擇親和配基目標(biāo)肽→反義肽→組合合成→親和篩選→優(yōu)選序列噬菌體展示技術(shù)目標(biāo)蛋白→可結(jié)合噬菌體→擴(kuò)增→多輪篩選單克隆群體→氨基酸序列SELEX技術(shù)隨機(jī)序列→PCR擴(kuò)增→特異性結(jié)合→重復(fù)篩選2021/6/2716親和洗脫目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用。2021/6/2717親和色譜親和層析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有對(duì)一類生物大分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合的特性而建立起來(lái)的一種分離的色譜方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。是親和分離技術(shù)中最具優(yōu)勢(shì)的方法2021/6/2718含配體溶液收集目的蛋白

洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白樣品平衡液帶有配體的樹脂珠（或膠粒）2021/6/2719親和作用體系將親和體系中的一種分子與固體粒子共價(jià)偶聯(lián)，可特異性結(jié)合另一種分子（目標(biāo)產(chǎn)物），使其從混合物中高選擇性地分離純化。一般將被固定的分子稱為其親和結(jié)合對(duì)象的配基（ligand），用L表示。Kd解離常數(shù)Keq結(jié)合常數(shù)2021/6/2720[E]、[L]和[E·L]分別表示蛋白質(zhì)、配基和其復(fù)合體的平衡濃度。結(jié)合常數(shù)Keq越大，或解離常數(shù)Kd越小，表示親和結(jié)合作用越強(qiáng)。Keq一般為104～108L/mol，有些最高可達(dá)到1015L/mol。低于103L/mol，親和結(jié)合作用太小，不能有效結(jié)合目標(biāo)。2021/6/27212021/6/2722親和層析的基本特點(diǎn)1、純化過程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高；2、特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子；3、純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高；4、必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件；2021/6/27235、價(jià)格相對(duì)較昂貴；6、在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。2021/6/2724基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)符合下面的要求：1．極低的非特異性吸附2．高度的親水性3．較好的理化穩(wěn)定性親和色譜介質(zhì)的制備2021/6/27254．大量的化學(xué)基團(tuán)能被有效地活化，而且容易和配體結(jié)合5．適當(dāng)?shù)亩嗫仔砸话阌H和吸附劑采用的基質(zhì)有纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、多孔玻璃珠等。2021/6/2726配基的選擇

根據(jù)配體對(duì)待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：

特異性配體（specificligand）通用性配體（generalligand）。2021/6/2727特異性配體特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。2021/6/2728配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對(duì)于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實(shí)驗(yàn)。2021/6/2729通用性配體

通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA、結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。2021/6/2730通用性配體對(duì)生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，所以在實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。2021/6/273132配基的濃度

對(duì)親和勢(shì)比較低的時(shí)候（KL≥10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。增加親和柱的長(zhǎng)度來(lái)提高吸附率。配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫困難。理想的配基濃度為1-10μmol/L。2021/6/273233配基偶聯(lián)的位置配基固定化時(shí)，其不參與親和結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對(duì)脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。2021/6/273334配基分子的大小

選用大分子配基。小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個(gè)“手臂”以消除空間障礙。2021/6/2734親和吸附介質(zhì)的配基

（1）酶的抑制劑一些物質(zhì)，它們并不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上的某些必需基團(tuán)（主要是指酶活性中心上的一些基團(tuán)）發(fā)生變化，因而引起酶活力下降，甚至喪失，致使酶反應(yīng)速度降低，能引起這類抑制作用的物質(zhì)稱為酶的抑制劑（inhibitor）。

2021/6/2735在生物體內(nèi)蛋白酶的抑制劑可與蛋白酶的活性部位結(jié)合，抑制酶的活性，必要時(shí)保護(hù)生物組織不受蛋白酶的損害。酶的抑制劑在分子大小和形態(tài)上分布較廣，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。2021/6/2736

（2）抗體利用抗體為配基的親和層析又稱為免疫親和層析（Immunoaffinitychromatography）?？贵w與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)一般為107～1012L/mol。因此，利用免疫親和層析法，特別是以單抗為配基的免疫親和層析法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。

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（3）蛋白A

蛋白A（proteinA）為分子量約42KD的蛋白質(zhì)，存在于黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁中，占該細(xì)胞壁構(gòu)成成分約5％。蛋白A在確定其為蛋白質(zhì)之前稱A抗原，與動(dòng)物免疫球蛋白G(immunogloblinG，IgG)具有很強(qiáng)的親和結(jié)合作用，結(jié)合部位IgG分子的Fc片斷（Y字型IgG分子的主干部分）。2021/6/2738蛋白A不與抗體（IgG）的抗原結(jié)合部位結(jié)合，而且任何抗體的Fc片斷的結(jié)構(gòu)都非常相似，因此蛋白A可作為各種抗體的親和配基，但不同抗體的結(jié)合常數(shù)有所不同。2021/6/2739

（4）凝集素

凝集素(lectin)是與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)（酶和抗體除外）的總稱，大部分凝集素為多聚體，含有兩個(gè)以上的糖結(jié)合部位，不同的凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。2021/6/2740例如，常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，ConA)與葡聚糖和甘露糖的親和結(jié)合作用較強(qiáng)，而麥芽糖凝集素（wheatgermagglutinin，WGA）與N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的親和結(jié)合作用較強(qiáng)。

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（5）輔酶和磷酸酰苷

各種脫氫酶和激酶需要在輔酶（coenzyme）的存在下表現(xiàn)其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和作用。輔酶主要有輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）、輔酶Ⅱ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADphosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等。2021/6/2742這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’,5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分與上述輔酶的結(jié)構(gòu)類似，與脫氫酶和激酶同樣具有親和結(jié)合作用，可用做這些酶的親和配基。2021/6/2743（6）色素配基三嗪類色素(triazinedyes)是一類分子內(nèi)含有三嗪環(huán)的合成活性染料,與各種需要在NAD的存在下表現(xiàn)其生物活性的脫氫酶和激酶具有結(jié)合作用。這類色素與NAD的結(jié)合部位相同,具有抑制酶活性的作用,因此又稱為生物模擬色素(biomimeticdye)。利用色素為配基的親和色譜法一般稱作色素親和色譜(dyeligandaffnitychromatography)。2021/6/2744除脫氫酶和激酶外,三嗪類色素還與很多蛋白質(zhì)具有結(jié)合能力,如血清白蛋白、干擾素、核酸酶、溶菌酶和糖解酶等,用途非常廣泛。色素與這些蛋白質(zhì)結(jié)合的作用機(jī)理很復(fù)雜,有些是疏水性相互作用,有些則是疏水性吸附和靜電吸附共同作用的結(jié)果。2021/6/2745CibacronBlue3GA(又稱ReactiveBlue2)最常用的活性色素2021/6/2746

（7）過渡金屬離子

Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等過渡金屬離子可與N、S和O等供電原子（electrondonoratom）產(chǎn)生配位鍵，因此，可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸(His)的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巰基和色氨酸（Trp）的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用，其中以His的咪唑基的結(jié)合作用最強(qiáng)。過渡金屬離子與咪唑基的結(jié)合強(qiáng)弱順序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。2021/6/2747過渡金屬離子可通過與亞胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金屬鹽固定在固定相粒子表面，用作親和吸附蛋白質(zhì)的配基。這種利用金屬離子為配基的親和色譜一般稱為金屬螯合親和色譜(metalchelateaffinitychromatography)或固定化金屬離子親和色譜(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)。2021/6/2748亞胺二乙酸（IDA）2021/6/2749

（8）組氨酸在各種氨基酸中，組氨酸的性質(zhì)比較獨(dú)特：具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。因此組氨酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。雖然這種親和作用的機(jī)理尚不十分清楚，但利用固定化組氨酸吸附蛋白質(zhì)以及吸附蛋白的洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結(jié)合。2021/6/2750在鹽濃度較低和pH約等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附作用最強(qiáng)，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。因此利用組氨酸為配基可親和分離等電點(diǎn)相差較大的蛋白質(zhì)，洗脫則可采用增大鹽濃度的梯度洗脫法。2021/6/2751

（9）肝素

肝素（heparin）是存在于哺乳動(dòng)物的肝、肺、腸等臟器中的酸性多糖類物質(zhì)，分子量一般為5～30KD，具有抗凝血作用。肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。肝素的親和結(jié)合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強(qiáng)，隨著鹽濃度的增大結(jié)合作用降低。2021/6/2752三、親和吸附劑及其制備方法將親和配基共價(jià)偶聯(lián)在固體粒子的表面(孔內(nèi))即可制備親和吸附劑。該固體粒子通常稱為配基的載體(carrier/support)。因此,親和吸附劑又稱親和載體(affinitycarrier/affinitysupport)。2021/6/2753載體的固體粒子應(yīng)滿足以下要求①具有親水性多孔結(jié)構(gòu),無(wú)非特異性吸附,比表面積大②物理和化學(xué)穩(wěn)定性高,有較高的機(jī)械強(qiáng)度,使用壽命長(zhǎng)③含有可活化的反應(yīng)基團(tuán),用于親和配基的固定化④粒徑均一的球形粒子2021/6/27542021/6/2755活化

基質(zhì)的活化是指通過對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán)。

介質(zhì)活化與耦聯(lián)2021/6/27561.溴化氰活化法用于多糖凝膠的活化,被固定的活性基團(tuán)為含氨基的配基(RNH2)。溴化氰(CNBr)對(duì)多糖類載體的活化在堿性(pH>10)條仵下數(shù)分鐘即可完成,之后的配基修飾亦需在堿性條件下進(jìn)行,一般使用碳酸鹽緩沖液。2021/6/2757反應(yīng)機(jī)理為CNBr為劇毒藥品,上述操作需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。CNBr活化法適用于RNH2型配基的修飾,如蛋白質(zhì)類配基。亞胺碳酸活性基團(tuán)異脲衍生物2021/6/2758活化耦聯(lián)過程20ml、2mol/L碳酸氫鈉+20g濕瓊脂糖，冰浴4-5min攪拌過程中加入溴化氰，4-5℃10min過濾，冷蒸餾水和緩沖液洗滌加入溶于緩沖液中的配基，攪拌2h，4℃保存2021/6/2759

這種方法的缺點(diǎn)是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會(huì)帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。2021/6/27602.環(huán)氧基活化法可用于多糖凝膠和表面為氨基的載體的活化,固定分子結(jié)構(gòu)為RNH2、ROH和RSH的配基。常用的活化試劑為1,4-丁二醇-二縮水甘油醚(簡(jiǎn)稱BGE)和環(huán)氧氯丙烷(epichlorohydrin)?；罨^程需在強(qiáng)堿條件下進(jìn)行。2021/6/2761以活化羥基為例,反應(yīng)機(jī)理為2021/6/2762引入活性基團(tuán)環(huán)氧基后,可采用下述直接法或間接法固定配基直接法固定配基2021/6/2763間接法固定配基2021/6/2764間接法固定配基2021/6/2765環(huán)氧基活化法在熱的濃堿溶液中，多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物；在堿性條件下，其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián)。2021/6/2766

這種活化方法的優(yōu)點(diǎn)是活化后不引入電荷基團(tuán)，而且基質(zhì)與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長(zhǎng)，而且便于在親和層析中使用較強(qiáng)烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。2021/6/2767它的缺點(diǎn)是用環(huán)氧氯丙烷活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時(shí)需要堿性條件，pH為9-13，溫度為20-40℃。這樣的條件對(duì)于一些比較敏感的配體可能不適用。

2021/6/27683.硅膠的活化活化硅膠常采用硅烷化試劑,如γ-氨丙基三甲(或乙)氧基硅烷和γ-(2,3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲(或乙)氧基硅烷等,反應(yīng)式分別為2021/6/2769引入活性氨基或環(huán)氧基后,可利用上述相應(yīng)方法固定配基。但需注意的是,硅膠在堿性溶液中不穩(wěn)定,所以固定化反應(yīng)不能在堿性條件下進(jìn)行。在酸溶液中環(huán)氧基可發(fā)生二醇化反應(yīng)2021/6/2770親和配基耦聯(lián)密度測(cè)定耦聯(lián)密度決定了介質(zhì)的吸附容量分光光度法量差法分析水解作用分析元素分析法結(jié)合量用每毫升或每克貯存膠束縛配基的量表示。即mg/mL2021/6/2771一般說(shuō)來(lái)，目標(biāo)產(chǎn)物的吸附容量隨配基固定化密度的提高而增大。但當(dāng)配基固定化密度過高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生空間位阻作用（sterichindrance），影響配基與目標(biāo)產(chǎn)物之間的親和吸附，配基的有效利用率降低。因此，配基固定化密度也不宜過高，通常存在最佳密度值范圍。2021/6/2772間臂分子當(dāng)配基的分子量較小時(shí)，將其直接固定在載體上，會(huì)由于載體的空間位阻，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。如果在配基與載體之間連接間隔臂，可以增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合。2021/6/2773加入間臂的長(zhǎng)度要恰當(dāng)，太短則效果不明顯；太長(zhǎng)則容易由疏水性非特異吸附造成彎曲，反而降低吸附效率。間臂的疏水性也需要考慮，應(yīng)盡量減小對(duì)配基的影響。如間臂和配基疏水性較強(qiáng)，則效果不明顯。2021/6/27742021/6/277576四、親和層析的吸附和洗脫

影響吸附的條件親和層析的洗脫親和吸附劑的再生2021/6/277677（一）影響吸附的條件

親和吸附劑及配體的性質(zhì)緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、pH、溫度和層析流速有關(guān)。溫度升高會(huì)使吸附作用減弱。流速每小時(shí)低于10ml/cm2。層析柱用前必須充分平衡。上樣體積為柱床體積的5%。2021/6/277778非專一性吸附

親和層析中的非專一性吸附。

離子效應(yīng)疏水基團(tuán)復(fù)合親和力2021/6/277879離子效應(yīng)

配基與載體-間隔臂的不完全結(jié)合，將無(wú)關(guān)離子基團(tuán)引入吸附劑。具有離子基團(tuán)的親和吸附劑會(huì)影響蛋白質(zhì)的洗脫行為。2021/6/277980疏水基團(tuán)

吸附劑疏水性基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團(tuán)：（1）長(zhǎng)的烴鏈結(jié)構(gòu)的“手臂”：（2）疏水性配基：2021/6/278081復(fù)合親和力離子效應(yīng)作用，又有疏水作用。配體與配基有較強(qiáng)生物特異性。用高濃度的鹽和有機(jī)溶劑，以提高選擇性。2021/6/278182（二）親和層析的洗脫洗脫：洗脫方法主要有三種：

非專一性洗脫特殊洗脫專一性洗脫2021/6/27821、非專一性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH值、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用，是使用較多的洗脫方法。2、特殊洗脫當(dāng)一些蛋白質(zhì)的吸附十分緊密，不能用非專一性吸附方法洗脫時(shí)，可用特殊的化學(xué)方法裂解配基與載體的連接鍵，獲得的配基－蛋白質(zhì)絡(luò)合物，再用透析或凝膠過濾除去配基。2021/6/27833、專一性洗脫以酶的親和層析為例，酶E吸附在親和柱上，S為固定化配基，洗脫劑中含有游離配基I并對(duì)酶的吸附產(chǎn)生影響，可能出現(xiàn)三種情況。①競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)：即ESI三元絡(luò)合物不如EI二元絡(luò)合物穩(wěn)定，因此增加洗脫劑中I，會(huì)使E洗脫下來(lái)（S＝I時(shí)）。②非競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)：當(dāng)ESI絡(luò)合物的穩(wěn)定性與EI相同時(shí)，I的存在并不影響E對(duì)S的結(jié)合，用I不能達(dá)到洗脫的目的。③反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)：即ESI三元絡(luò)合物比EI二元絡(luò)合物穩(wěn)定，游離配基I的存在使酶與固定化配基S結(jié)合更緊密。2021/6/278485非專一性洗脫

改變洗脫劑的pH。離子強(qiáng)度的分步和梯度變化.親和勢(shì)很高，促溶離子，其洗脫能力的強(qiáng)弱順序Cl－<I－<CF3COO－<SCN－

<CCl3COO－。用蛋白質(zhì)變性劑（如脲或鹽酸胍）。2021/6/278586特殊洗脫裂解配基與載體的連接鍵。斷裂方法有：硫酯鍵用羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。2021/6/278687專一性洗脫S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）（1）競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會(huì)使E洗脫下來(lái)（正洗脫）。（2）當(dāng)ESI穩(wěn)定性與EI相同時(shí)，I的存在并不影響E對(duì)S的結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)。（3）反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)，即ESI比EI穩(wěn)定，I使E與S結(jié)合更緊密（負(fù)洗脫）

。2021/6/278788（三）親和吸附劑的再生用緩沖液充分平衡后即可重復(fù)使用。親和力下降，非特異吸附增加，大多由變性蛋白沉積造成，用6mol/L脲洗柱。2021/6/2788五、常見的親和色譜核苷酸及輔酶親和色譜固定化金屬離子親和色譜（IMAC）染料親和色譜免疫親和色譜基團(tuán)專一性大分子親和色譜2021/6/2789（一）核苷酸及輔酶親和色譜指將核苷酸（或輔酶）作為親和配基固定在色譜介質(zhì)上進(jìn)行親和色譜的技術(shù)，主要利用核苷酸特別是輔酶因子和蛋白質(zhì)之間的專一性識(shí)別達(dá)到分離純化目的。2021/6/27902021/6/2791介質(zhì)制備碳二亞胺直接法偶聯(lián)溴化氫活化瓊脂糖→連接氨基己酸→加入核苷酸→溶液中保存→洗滌→偶聯(lián)間接偶聯(lián)法間臂分子和核苷酸→活化的介質(zhì)2021/6/2792吸附和解吸選擇合適的緩沖液條件下吸附一般采用輔酶或鹽溶液進(jìn)行梯度洗脫2021/6/2793（二）固定化金屬離子親和色譜蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合，從而達(dá)到分離的目的。金屬離子如鋅和銅。2021/6/279495將活化的介質(zhì)與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。金屬螯合劑：亞氨二醋酸、氨基水楊酸、8-羥基喹啉、羧甲基氨基酸等。2021/6/2795親和作用機(jī)理靜電作用配位鍵結(jié)合氫鍵疏水相互作用弱共價(jià)鍵氨基與甲酰基之間形成的Schiffbase醛基與羥基之間形成的半縮醛（hemiacetal）2021/6/2796吸附采用50mmol/L的金屬鹽溶液通過色譜柱，直至色譜介質(zhì)吸附飽和。平衡緩沖溶液洗去未螯合的金屬離子加入適宜濃度的NaCl和選擇合適pH值有利于減少非特異性吸附。2021/6/2797解吸吸附蛋白質(zhì)解吸的方法：改變pH值競(jìng)爭(zhēng)性洗脫采用50-100mmol/L的EDTA洗脫，可將蛋白質(zhì)和金屬離子解吸，洗滌，重新上柱平衡，固定所需的金屬離子。2021/6/279899（三）染料親和色譜有機(jī)染料具有類似于NAD+的結(jié)構(gòu)。需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對(duì)染料具有一定親和力。染料共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，能制得親和層析柱。染料親和層析已成功的分離純化了多種酶。2021/6/27992021/6/27100染料親和色譜介質(zhì)的制備配基性質(zhì)、染料結(jié)構(gòu)和染料取代度是制備過程中需要考慮的主要因素。以下途徑可以實(shí)現(xiàn)制備：采用瓊脂糖凝膠，染料連接在-OH上，該過程可在一定條件下直接完成。染料也可通過活性基團(tuán)和基質(zhì)偶聯(lián)，該方法可引入高密度的染料。2021/6/27101吸附蛋白質(zhì)量增多選擇親和作用力較小的染料有利于解吸2021/6/27102吸附與解吸采用磷酸鹽緩沖液，在pH6.0-7.0條件下吸附常用解吸方法：增加鹽濃度改變pH值采用水溶性高聚物親和洗脫最后對(duì)雜蛋白進(jìn)行變性處理，洗滌、緩沖液平衡再生介質(zhì)。2021/6/27103（四）免疫親和色譜抗原和抗體的作用具有高度的專一性,并且它們的結(jié)合親和力極強(qiáng)。因此用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到吸附劑上,便可有效地分離和純化免疫物質(zhì)。特點(diǎn)：分離效率高，成本高，而且蛋白質(zhì)親和配基不穩(wěn)定，容易降解。2021/6/27104免疫親和色譜過程目標(biāo)蛋白質(zhì)抗體制備上樣與洗脫介質(zhì)制備2021/6/27105單抗制備復(fù)雜，成本高，但也具有很多優(yōu)點(diǎn)。2021/6/27106色譜介質(zhì)制備：將抗體通過化學(xué)方法結(jié)合在色譜介質(zhì)上抗體之間交聯(lián)形成不溶性衍生物2021/6/27107單抗問世后,不少生物技術(shù)公司在研制適宜于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的生物反應(yīng)器及其培養(yǎng)基。這些大規(guī)模生產(chǎn)單抗技術(shù)的建立和不斷完善,將降低免疫親和色譜吸附劑的價(jià)格。隨著新的合成基質(zhì)和偶聯(lián)化合物的出現(xiàn)以及對(duì)免疫親和色譜研究的深入,必將使免疫親和色譜在工業(yè)性生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)的應(yīng)用上逐漸得到發(fā)展。2021/6/27108解吸特異性解吸——半抗原置換非特異性解吸——調(diào)節(jié)pH值、加入試劑破壞氫鍵、引入離子對(duì)、加入表面活性劑、冷蒸餾水洗滌。2021/6/27109應(yīng)用根據(jù)研究報(bào)道,用單克隆抗體親和色譜從人血小板破碎液中純化血小板第4因子(PF4)。將單克隆抗體Sz-95-LgG與溴化氰活化的Spharose4B凝膠連接成親和色譜柱,人血小板破碎液經(jīng)此親和色譜柱上樣后,經(jīng)洗脫獲得PF4。結(jié)果表明,Sz-95-Sepharose4B親和色譜柱的偶聯(lián)率為72%,每1mL血小板破碎液中可以純化到PF418μg。2021/6/27110（五）基團(tuán)專一性大分子親和色譜指用對(duì)某一類結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)有親和性的大分子作為親和配基偶聯(lián)在色譜介質(zhì)上進(jìn)行的色譜技術(shù)。蛋白A親和色譜伴刀豆球蛋白A親和色譜肝素親和色譜2021/6/271111）分離純化大分子物質(zhì)如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的結(jié)構(gòu)與功能分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。六、親和色譜的應(yīng)用2021/6/27112樣品2021/6/27113t-PA的純化—酶的抑制劑為親和配基t-PA組織纖溶酶原激活劑2021/6/27114組織纖溶酶原激活劑（t-PA）是一種糖蛋白，治療血栓等心腦血管的蛋白藥物；存在于動(dòng)物心臟，現(xiàn)重組DNA動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)t-PA；親和配基有賴氨酸、精氨酸、氨基芐脒和纖維蛋白。2021/6/27115干擾素的純化—免疫親和色譜2021/6/27116干擾素（IFN），生理活性蛋白質(zhì)，對(duì)癌癥、肝炎等疾病具有特殊療效。分α、β的γ三種類型。通過動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、基因重組大腸桿菌或重組枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。親和配基用三嗪類色素。2021/6/27117脫氫酶的純化—色素親和色譜2021/6/27118三嗪類色素配基，低濃度鹽溶液色譜，同濃度鹽溶液清洗。若目標(biāo)產(chǎn)物的親和作用較強(qiáng)時(shí)，可用輔酶或色素溶液為特異性洗脫劑的逐次或線性梯度洗脫。2021/6/27119淀粉酶抑制劑的純化—固定化金屬離子親和色譜2021/6/27120（IMAC）根據(jù)蛋白質(zhì)表面與金屬離子螯合的氨基酸殘基（如咪唑基、巰基和吲哚基等）的含量和分布的差別分離純化蛋白質(zhì)，適用范圍廣，無(wú)毒副作用，吸附容量高。采用提高離子強(qiáng)度或降低pH值的逐次或線性洗脫法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的親和吸附作用很強(qiáng)時(shí)，可利用EDTA等螯合劑，將蛋白質(zhì)和金屬離子一起洗脫下來(lái)。2021/6/27121基因重組融合蛋白的純化2021/6/27122基因重組技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品:干擾素、白細(xì)胞介素(IL)、集落刺激因子、胰島素、t-PA、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)等。將具有特殊分子識(shí)別作用的基團(tuán)(如氨基酸、肽鏈、蛋白質(zhì)等)的基因與目標(biāo)產(chǎn)物的基因克隆相連接，制備融合基因。

2021/6/27123此融合基因的表達(dá)產(chǎn)物就是連接有特定分子識(shí)別基團(tuán)的目標(biāo)蛋白質(zhì)—基因重組融合蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)稱融合蛋白。與目標(biāo)蛋白相融合的分子基團(tuán)稱為融合蛋白的親和標(biāo)識(shí)物。這樣，利用親和標(biāo)識(shí)物的特異性親和吸附劑就可簡(jiǎn)單地親和純化目標(biāo)產(chǎn)物。親和標(biāo)識(shí)物:聚組氨酸六肽、聚苯丙氨酸、精氨酸、八肽等。2021/6/27124125

七、其他親和純化技術(shù)（一）親和過濾（膜分離）（二）親和分配（雙水相萃?。ㄈ┯H和反膠團(tuán)萃?。ǚ茨z團(tuán)萃?。ㄋ模┯H和沉淀（沉淀分級(jí)）（五）親和電泳（電泳）2021/6/27125126（一）親和過濾（AffinityFiltration）將親和層析和膜過濾技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，包括親和錯(cuò)流過濾和親和膜分離。親和錯(cuò)流過濾（affinityCrossFlowFiltration,ACFF）:是將親和層析與超濾技術(shù)結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應(yīng)后，用膜進(jìn)行錯(cuò)流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點(diǎn)。2021/6/27126127親和錯(cuò)流過濾

（affinityCrossFlowFiltration）

基質(zhì)及大分子親和配基基質(zhì)是聚合物組成的內(nèi)核，親和配基連接在內(nèi)核表面。配基對(duì)提取的目標(biāo)物進(jìn)行專一可逆的吸附，形成復(fù)合體；用膜對(duì)混合液進(jìn)行錯(cuò)流過濾，復(fù)合體因分子巨大可被保留，雜質(zhì)隨液體透過膜，目標(biāo)物與其它成分分離。

2021/6/27127128基質(zhì)

聚丙烯酰胺

菌類的完整細(xì)胞

（酵母、芽胞桿菌、鏈球菌等細(xì)胞）

瓊脂糖、脂質(zhì)體等

酵母細(xì)胞純化伴刀豆球蛋白A2021/6/27128129親和膜

（affinitymembrane）親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是固定床親和層析的變型。

將一張微濾膜比喻為一個(gè)固定床，膜厚為床層高度。

2021/6/27129130親和膜優(yōu)點(diǎn)

傳質(zhì)阻力小，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短；配基利用率高，配基用量低；壓降小，流速快；設(shè)備體積小。2021/6/27130131（二）親和萃取

（Affinityextraction）定義：利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進(jìn)行的雙水相萃取，在親和配基的親和結(jié)合作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在PEG相（上相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。

PEG/Dextran,PEG/無(wú)機(jī)鹽2021/6/27131132mA