《獸藥產(chǎn)品中4種氨基糖苷類獸藥含量的同時(shí)測(cè)定 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法》

ICS

CCS

GDNB

廣東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDNBXXXX—2023

獸藥產(chǎn)品中4種氨基糖苷類獸藥含量的同

時(shí)測(cè)定高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

Simultaneousdeterminationoffouraminoglycosidesinveterinarydrug

productsbyhighperformanceliquidchromatography-evaporativelight

scatteringmethod

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

廣東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)?發(fā)布

T/GDNBXXXX—2023

獸藥產(chǎn)品中4種氨基糖苷類獸藥含量的同時(shí)測(cè)定

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

1范圍

本文件規(guī)定了氨基糖苷類獸藥產(chǎn)品中主成分含量檢測(cè)的高效液相色譜測(cè)定方法。

本文件適用于氨基糖苷類獸藥產(chǎn)品中（大觀霉素、卡那霉素、安普霉素、新霉素）主成分含量的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文

件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4檢測(cè)原理

采用高效液相色譜，在選定的工作條件下，通過AcclaimAmGC18色譜柱分離樣品溶液中多種獸藥，

用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)4種氨基糖苷類藥物的同時(shí)分析，測(cè)定主成分含量的同時(shí)監(jiān)

測(cè)未標(biāo)示物的添加。

5試劑和材料

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。

試劑

5.1.1水：符合GB/T6682-2008規(guī)定的一級(jí)水指標(biāo)。

5.1.2甲醇(CH3OH)：色譜純；CAS號(hào)：67-56-1。

5.1.3三氟乙酸(C2HF3O2)：CAS號(hào)：76-05-1。

溶液配制

5.2.1三氟乙酸的配制：準(zhǔn)確量取三氟乙酸3.8mL，用超純水定容至1L。充分混勻后即得濃度為0.05

mol/L的三氟乙酸溶液。

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對(duì)照品

5.3.1卡那霉素對(duì)照品：CAS號(hào)：8063-07-8，純度≥95.4，見附錄A。

5.3.2安普霉素對(duì)照品：CAS號(hào)：37321-09-8，純度≥95.0，見附錄A。

5.3.3大觀霉素對(duì)照品：CAS號(hào)：1695-77-8，純度≥95.5，見附錄A。

5.3.4新霉素對(duì)照品：CAS號(hào)：1404-04-2，純度≥90.0，見附錄A。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

5.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取上述4種氨基糖苷類抗生素對(duì)照品約10mg，分別置于10mL容量瓶

中，依次用超純水溶解并定容，配制成濃度為5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20℃下保存。

5.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確移取1mL上述4種藥物5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10mL容量

瓶中，超純水定容，配制成濃度為500μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃冷藏保存。根據(jù)實(shí)際需要用超純水

稀釋配制成一系列濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

材料

5.5.1濾膜：0.45μm有機(jī)濾膜。

6儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters2695型高效液相色譜儀配備2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

色譜柱：AcclaimAmGC18柱，柱長(zhǎng)150mm，柱內(nèi)徑4.6mm，5μm粒徑，或等同性能者。

分析天平：感量0.1mg。

容量瓶：1000mL、100mL、10mL。

微量移液器：20-200μL、100-1000μL量程。

7測(cè)定步驟

試樣提取

粉劑和預(yù)混劑樣品：稱取大觀霉素、卡那霉素、安普霉素和新霉素試品適量（按標(biāo)示含量折算約含主

成分100mg），于100mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，混勻、過濾，配制成濃度為1mg/mL的供試

品溶液，再用初始流動(dòng)相比例稀釋配制成濃度為100μg/mL的混合供試品溶液。

注射液樣品：準(zhǔn)確移試品溶液溶液適量體積，置于10mL容量瓶中，以超純水溶解并定容，配制成濃

度為1mg/mL的供試品溶液，再用初始流動(dòng)相比例稀釋配制成濃度為100μg/mL的混合供試品溶液。

儀器參考條件

7.2.1液相色譜參考條件

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7.2.1.1色譜柱：AcclaimAmGC18柱，柱長(zhǎng)150mm，柱內(nèi)徑4.6mm，5μm粒徑，或等同性能者。

7.2.1.2流動(dòng)相：A為：0.05mol/L三氟乙酸水，B為：甲醇。

7.2.1.3洗脫程序：梯度洗脫（梯度洗脫程序見表1）。

7.2.1.4流速：0.5mL/min。

7.2.1.5柱溫：25℃。

7.2.1.6進(jìn)樣量：10μL。

表1梯度洗脫程序表

時(shí)間（min）A相（%）B相（%）變化曲線

09916

39556

79556

109916

7.2.2ELSD參數(shù)

7.2.1.1霧化氣體壓力（Nebulizergaspressure）：30psi。

7.2.1.2漂移管溫度（Drift-tubetemperature）：50℃。

7.2.1.3噴霧器模式（Impactormode）：加熱。

7.2.1.4霧化器溫度（nebulizertemperature）：36℃。

7.2.1.5動(dòng)力級(jí)別：60%。

7.2.1.6增益（Gain）：50。

7.2.1.7采集頻率：1。

7.2.1.8時(shí)間常數(shù)：慢速。

色譜分析條件標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)定

分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用初始流動(dòng)相稀釋為濃度為25，50，75，100，150，200μg/mL的混

合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述色譜條件進(jìn)樣。分別以藥物的濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)x，藥物峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐

標(biāo)y作圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)（r）。如果r大于0.999表明該方法在藥物濃度在所選濃度范圍

內(nèi)線性良好。

試樣測(cè)定

將供試品溶液（見7.1）按色譜條件（見7.2）進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，由色譜峰

面積從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上計(jì)算出相應(yīng)的4種獸藥的濃度。供試品溶液4種獸藥的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測(cè)定的線性

范圍內(nèi)，否則應(yīng)重新調(diào)整濃度后測(cè)定。本方法4種氨基糖苷類獸藥對(duì)照品的典型高效液相色譜圖見附錄B。

平行試驗(yàn)

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按以上步驟，對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。

8結(jié)果計(jì)算

試樣中氨基糖苷類藥物主成分的含量X（μg/kg），按公式（1）計(jì)算：

C×V………………（1）

X=

m

式中：

X—試樣中氨基糖苷類藥物主成分的含量，μg/kg；

C—試樣溶液中相應(yīng)的氨基糖苷類藥物的濃度，ng/mL；

V—提取溶劑的體積，mL；

m—供試試料的質(zhì)量，g。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算數(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度

在實(shí)驗(yàn)濃度0.25mg/mL～1mg/mL內(nèi)，4種氨基糖苷類藥物的平均回收率在91.0%～109.0%之間。

精密度

本方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.3%。

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附錄A

（資料性）

4種氨基糖苷類獸藥的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4種氨基糖苷類獸藥的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)式，見表A。

表A4種氨基糖苷類獸藥的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)式

中文名

號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量化學(xué)結(jié)構(gòu)式

（英文名）CAS

卡那霉素

8063-07-8C18H36N4O11484.499

（Kanamycin）

安普霉素

37321-09-8C21H41N5O11539.583

（Apramycin）

大觀霉素

1695-77-8C14H24N2O7332.35

（Spectinomycin）

新霉素

1404-04-2C23H46N6O13908.879

（Neomycin）