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細胞復蘇失敗原因分析-復蘇篇_第1頁
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細胞復蘇失敗原因分析——復蘇篇細胞復蘇成敗和凍存及復蘇操作密切相關(guān)。上個星期和大家分享了細胞凍存方面容易出錯的細節(jié)，詳見《細胞復蘇失敗原因分析——凍存篇》。本篇主要從復蘇角度分析，排查復蘇過程中容易出現(xiàn)的問題。同樣，我們先復習一下復蘇步驟：1.提前將水浴鍋預熱至37℃，培養(yǎng)基復溫，離心機設置好轉(zhuǎn)速；2.準備一個15ml離心管并加入適量培養(yǎng)基。3.取出凍存管，浸入水浴鍋迅速搖晃使細胞在2min內(nèi)充分融化；4.將細胞懸液緩慢滴入提前加了培養(yǎng)基的離心管，1000rpm3min離心；5.棄上清，重懸細胞并接種至培養(yǎng)器皿中，放入培養(yǎng)箱。復蘇常見的錯誤操作1.若液氮或冰箱距離水浴鍋較遠，沒有做保冷措施為防止細胞在運輸路上開始融化（特別是夏季），凍存細胞需要放在干冰或冰盒上運送至水浴鍋。2.運輸凍存管時手觸碰到細胞部分或放在了口袋里請勿用手觸碰凍存管身，避免局部溫度升高導致細胞開始融化。應捏住管蓋或放在容器中運輸3.采用錯誤的方式融化細胞不要用手捂化（搓熱也不行），手心溫度不夠高，細胞受熱不均勻且降溫速度太慢導致細胞死亡。4.水浴時沒有嚴格控制時間，直接放水里靜置，沒有晃動促進融化細胞復蘇需遵循“快融”原則，建議在2min內(nèi)將細胞充分融化，水浴時間越長活率越低。最好的方法是捏住管蓋，將管身浸沒水中快速搖晃，促進細胞融化。切忌將凍存管靜置在水浴中。5.水浴結(jié)束時管內(nèi)還有較大冰塊如果沒融化完全，還有比較大的冰塊，也會導致細胞死亡。一方面冰塊中的細胞緩慢升溫而死亡，另一方面冰塊導致已融化的細胞被低溫損傷。有的同學說2min的水浴很難讓細胞融化，那么咱們可以將水浴鍋溫度提高至39度（小編親測可行），搖晃速度加快，擔心污染可以將凍存管放在一次性PE手套內(nèi)再進行水浴。水浴鍋里的水不能太少，否則凍存管放入水后局部溫度會達不到預設溫度，導致融化過慢。6.細胞融化后沒有離心去除DMSO有的同學復蘇細胞會在細胞融化后加10倍培養(yǎng)基稀釋，不離心直接培養(yǎng)，等細胞貼壁后換液。雖然這對于好養(yǎng)的貼壁細胞是可行的，但不是長遠之計，也不適用于懸浮細胞。DMSO對細胞有一定毒性，有些細胞對DMSO比較敏感，如HL-60細胞等。如果你不清楚自己的細胞是否對DMSO敏感，那么還是離心去除上清最為保險。以上由小尚多年經(jīng)驗總結(jié)而

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