大學(xué)-師范類-化學(xué)專業(yè)-儀器分析學(xué)科-第三章高效液相色譜法

第3章

高效液相色譜分析

HighperformanceLiquidChromatography(HPLC)

InstrumentalAnalysis內(nèi)容

§3-1高效液相色譜分析概述§3-2影響色譜峰擴展及色譜分離的因素§3-3主要類型及其分離原理§3-4液相色譜法固定相

§3-5液相色譜法流動相§3-6高效液相色譜儀

應(yīng)用HPLC§3-1概述高效液相色譜法是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù)建立起來的一種液相色譜分析法。HPLC一、HPLC與經(jīng)典液相色譜法的差別

柱內(nèi)徑1～3cm固定相粒徑

>100μm流動相驅(qū)動方式重力或低壓泵HPLC經(jīng)典LCHPLC3-10μm高壓泵<10μm速度快柱效高二、HPLC與GC差別1、流動相GC：流動相為惰性氣體HPLC：流動相為液體2、操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。〩PLC3．分析對象不同

GC：分析易氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測占有機物的20%HPLC：分析溶解后能制成溶液的樣品；分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%三、HPLC的特點（1）高壓（2）高速（3）高效（4）高靈敏度四、HPLC的應(yīng)用只要試樣能制成溶液的物質(zhì)原則上都可用HPLC法進行分離，分析。尤其適合于那些不宜用GC分析的難揮發(fā)物質(zhì)，熱不穩(wěn)定物質(zhì)，離子型物質(zhì)和生物大分子等。

概述§3-2影響色譜峰擴展及色譜分離的因素理論基礎(chǔ)熱力學(xué)理論：塔板理論動力學(xué)理論：速率理論HPLCGC：速率理論方程A：渦流擴散項B/u：分子擴散相

Cu：傳質(zhì)阻力項HPLC一、液相色譜速率理論

——影響色譜擴展的因素HPLC

渦流擴散項？

分子擴散相？傳質(zhì)阻力項？1、渦流擴散項He

dp——固定相顆粒的平均直徑

λ——填充不均勻因子

故要減小He，提高柱效，應(yīng)采用小顆粒固定相并填充均勻。HPLC

cd

：常數(shù)

Dm

：分子在流動相中的擴散系數(shù)

u:流動相流速

Dm

一般很小，當u較大時，Hd很小，Hd可忽略2、分子擴散相Hd（縱向擴散項）HPLC3、傳質(zhì)阻力項

HPLC

（1）固定相傳質(zhì)阻力項

df——固定液的液膜厚度

Ds——試樣分子在固定液內(nèi)擴散系數(shù)

Cs——與容量因子有關(guān)的系數(shù)故要減小Hs，提高柱效，應(yīng)使用液膜厚度小的固定相，具有擴散系大的固定液及低流速。

HPLC（2）流動相傳質(zhì)阻力項①流動的流動相中傳質(zhì)阻力項Hm

Dm——試樣分子在固定液內(nèi)擴散系數(shù)（與試樣粘度成反比，與溫度成正成比）故要減小Hm，提高柱效，應(yīng)采用小顆粒固定相，低粘度流動相、低流速。

HPLC固定相顆粒體積越大，微孔越深，傳質(zhì)越慢，色譜峰擴展越嚴重。故要減小Hsm,提高柱效，應(yīng)采用小顆粒，微孔淺孔徑越的固定相及低流速。

②滯留流動相的傳質(zhì)阻力項Hsm

HPLC由柱內(nèi)色譜峰擴展所引起塔板高度變化可歸內(nèi)為：

HPLC可簡寫為著H=He

+Hd+HS+HMM+HSM忽略分子擴散項小結(jié)降低塔板高度，提高柱效及分離效果的方法：

①減小固定相的顆粒直徑；②降低流動相的粘度；③在一定范圍內(nèi)減小流動相線速；HPLC二、影響分離的因素——流速HPLC：

H～u圖HPLCGC：H～u圖在液相色譜中，使用較高流速，柱效不會明顯下降，故可采用高流速進行快速分析。三、柱外展開（柱外效應(yīng)）HPLC柱外展寬：色譜柱外各種因素引起的色譜峰擴展。例如：進樣系統(tǒng)連接管檢測器的死體積§3-3主要類型及其分離原理一、液—液色譜法二、液—色固譜法三、離子對色譜法四、離子交換色譜法五、離子色譜法六、空間排阻色譜法HPLC一、液-液分配色譜法

1、固定相固定相：擔(dān)體+固定液（物理或機械涂漬法）

固定液的選擇：相似相溶原則

固定液與流動相互不相溶常用的固定液：，—氧二丙腈（ODPN）聚乙二醇（PEG）十八烷（ODS）角鯊?fù)镠PLC2、分離原理：由于試樣組分在固定相和流動相之間的相對溶解度存在差異，故根據(jù)組分在兩相間的分配系數(shù)不同來分離的。因此，要達到好的分離效果，既要選擇合適的固定相，也要選擇合適的流動相。HPLCK不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流動相的種類有關(guān)3、液液分配色譜的分類：根據(jù)固定液與流動相的相對極性強弱不同可分為：（1）正相色譜法：

固定液極性>流動相極性

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分（2）反相色譜法：

固定液極性<流動相極性極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分HPLC4、化學(xué)鍵合固定相（1）化學(xué)鍵合固定相的定義：

利用化學(xué)反應(yīng)通過共價鍵將有機分子鍵合在載體（硅膠）表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相。

HPLC（2）鍵合固定相的制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷非極性硅烷化反應(yīng)鍵合固定相類型疏水基團烷烴（C8和C18）、苯基等極性基團丙氨基氰乙基醚和醇等離子交換基團胺基、季銨鹽磺酸、羧酸（3）鍵合固定相的特點①柱效高；

②無固定液流失③應(yīng)用范圍廣；④有利于梯度洗脫。

。保留時間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸固定相:非極性;流動相:極性組分極性:3,4-二羥基苯甲酸<沒食子酸二、液—固吸附色譜法

（liquid-solidadsorptionchromatograph）1、固定相固定相：吸附劑（多孔的固體顆粒）常用的吸附劑：極性：硅膠（薄殼硅膠、全多孔硅膠）、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩、聚酰胺非極性：

活性碳

HPLC2、分離的原理根據(jù)不同組分在吸附劑表面吸附和解吸能力的差異來進行分離的。其作用的機制：溶質(zhì)分子（X）和溶劑分子（S）對吸附劑表面的競爭吸附。吸附平衡：

Xm+nSa======Xa+nSm

式中：Xm--流動相中的溶質(zhì)分子；

Sa--固定相中的溶劑分子；

Xa--固定相中的溶質(zhì)分子；

Sm--流動相中的溶劑分子。

HPLC當吸附競爭反應(yīng)達平衡時：

K=[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]n

式中：K為吸附平衡常數(shù)。[討論]：

K越大，保留值越大。

HPLC例：硅膠（SiO2·H2O）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心

特性：

1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性↑，吸附能力↑→強極性吸附中心，不易洗脫2）吸水→失活→105～110OC烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性喪失，無吸附力適用：分析酸性或中性物質(zhì)

3、吸附劑和流動相的選擇：

依據(jù)被測組分、吸附劑和流動相的性質(zhì)①.吸附劑的選擇

強極性物質(zhì)——選擇弱吸附劑弱極性物質(zhì)——選擇強吸附劑②流動相的選擇：

流動相極性↑大，對極性被測組分的洗脫能力↑大應(yīng)用“相似相溶”原則，根據(jù)組分性質(zhì)、吸附劑的活性，選擇適當極性的流動相。4

應(yīng)用

具有不同官能團的化合物

具有相同官能團，但數(shù)量不同的化合物

異構(gòu)體例：幾種取代位置不同的硝基苯胺的分離。在硅膠吸附劑上的滯留順序：鄰位<間位<對位鄰硝基苯胺間硝基苯胺對硝基苯胺適合分離的物質(zhì)三、離子對色譜法

1、固定相：與液-液分配色譜中固定相相同

2、方法原理

將一種(或多種)與溶質(zhì)分子電荷相反的離子

(稱為對離子或反離子)加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。

HPLC3、分類：根據(jù)流動相和固定相的性質(zhì)可分為

①

正相離子對色譜法

②反相離子對色譜法例：用反相離子對色譜法分離試樣離子X+。

固定相：非極性的疏水(C-18柱)（有機相）

流動相：含有對離子Y-的流動相（水溶液）

分離過程：試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y-X+（呈中性締合物

，在兩相間分配。HPLC例：鹽酸嗎啡的分析（兩性）17-甲基-3-羥基-4，5a-環(huán)氧-7，8-二脫氫嗎啡喃-6a-醇（鹽酸

鹽三水合物）分離示意圖：33++()+3s3(+疏水性固定相（有機相）+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對mB+ABAmA(s流動相（水相）通式疏水性離子對不易在水中離解而迅速進入有機相中，存在下述萃取平衡：X+水相+Y-水相X+Y-有機相KXY平衡常數(shù)：分配系數(shù)可通過調(diào)節(jié)對離子濃度，改變樣品離子的保留值。X+水相+Y-水相X+Y-有機相[X+Y-]有機相[X+]水相[Y-]水相KXY=[X+Y-]有機相[X+]水相D==KXY[Y-]水相4、應(yīng)用：適用于有機酸、有機堿和離子、非離子混合物的分離，尤其對一些生化試樣如核苷、核酸、兒茶酚胺，生物堿以及藥物等分離。HPLC四、離子交換色譜法1、分離原理離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，依據(jù)這些離子與交換劑具有不同的親和力而將它們分離。HPLC2、固定相HPLC①離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)帶有活性基團的網(wǎng)狀高分子聚合物骨架活性基團聚乙烯樹脂酸性基團堿性基團—SO3H—COOH—N+R3—NR2特殊基團②分類據(jù)所含交換基團的性質(zhì)分為：陽離子交換樹脂

強酸型含磺酸基團(R-SO3H)

中等酸型含磷酸基團(-O-PO2H4)

弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂

強堿含季胺基團[-N+(CH3)3]

弱堿含叔胺、伯胺基團[-N(CH3)2

HPLC陽離子交換樹脂陽離子交換陰離子交換3、流動相水相緩沖液+有機溶劑調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)鹽種類及濃度pH值各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快4、應(yīng)用：離子及可離解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等

HPLC五、離子色譜法1、分離原理離子交換原理

2、固定相：離子交換樹脂3、流動相：電解質(zhì)溶液

HPLC4、儀器：分離柱：離子交換

抑制柱：消除流動相中強電解質(zhì)背景離子檢測器：電導(dǎo)檢測器HPLC淋洗液槽泵進樣閥分離柱

電導(dǎo)檢測

抑制柱

記錄儀輸送分離檢測數(shù)據(jù)處理圖離子色譜儀流程圖5、分離及抑制過程：（1）分離過程（測定樣品中X-）交換：

R+-OH-+Na+X-→R+-X-+Na+OH-洗脫：

R+-X-+Na+OH-→R+-OH-+Na+X-

（2）抑制過程

Na+OH-+R--H+→R--Na++H2ONa+X-+R--H+→R--Na++H+X-

HPLC6、應(yīng)用

離子尤其是陰離子的檢測

HPLC六、空間排阻(凝膠)色譜法1、分離原理：基于被分離組分的分子大小和形狀不同來實現(xiàn)分離的。2、固定相：

固定相是凝膠，是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔徑或立體網(wǎng)狀的物質(zhì)。類似于分子篩的作用。HPLC3、分離過程大分子——不能滲入凝膠的孔穴中,而被排阻，而直接流過色譜柱，最先流出。中等分子——部分滲透，中等速度流過色譜柱小分子——完全滲透，最后流出。樣品組分按它們的分子大小被分離，出峰順序為從大到小。HPLC4、流動相試樣的分離并不依賴于溶劑與試樣間的相互作用力。溶劑的選擇主要是從對樣品的溶解能力,溶劑與儀器的匹配以及實驗結(jié)果處理的方便來考慮的。HPLC5、應(yīng)用：①可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離②廣泛應(yīng)用于大分子的分級。③非常適合于未知樣品的初步探索分離。HPLC*總結(jié)：分離類型選擇

choiceofseparationtypes§3-5液相色譜法流動相1.流動相特性

(1)液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；

HPLC2.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。3.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)4.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收?！?-6高效液相色譜儀HPLC一、流程及主要部件流程3、分離系統(tǒng)（高效分離柱）

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。1、在高效液相色譜法中，VanDeemter方程中哪項對色譜峰的影響可忽略？【B】A.渦流擴散項B.分子擴散項C.流動區(qū)域的流動相傳質(zhì)阻力D.停滯區(qū)域的流動相傳質(zhì)阻力2、在液相色譜法中，提高柱效最有效的途徑是