液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)人體血漿中的奧司他韋和奧司他韋羧酸

液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)人體血漿中的奧司他韋和奧司他韋羧酸1.摘要采用HPLC法進(jìn)行人體血漿中的奧司他韋及其活性代謝物奧司他韋羧酸濃度測(cè)定。方法:ACEExcel5C182.1*50mm色譜柱，水相：0.1%甲酸水溶液，有機(jī)相：乙腈，流速0.4mL/min，柱溫為35℃。實(shí)驗(yàn)用樣品則需要進(jìn)行甲醇提取進(jìn)樣，監(jiān)測(cè)模式為MRM，進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量分析（奧司他韋-d3/奧司他韋羧酸-d3為內(nèi)標(biāo)）。結(jié)果：經(jīng)驗(yàn)證的奧司他韋的線性定量范圍為0.500ng/mL~200ng/mL，奧司他韋羧酸的線性定量范圍為2.00ng/mL~800ng/mL。奧司他韋高、中、低3個(gè)濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.13%、94.22%、91.89%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為89.53%，奧司他韋羧酸高、中、低3個(gè)濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.54%、95.87%、91.46%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為88.83%，表明在本方法的定量范圍內(nèi)奧司他韋和奧司他韋羧酸具有足夠、相對(duì)均一的提取回收率，且內(nèi)標(biāo)具有較高的回收率。結(jié)論：本方法對(duì)于測(cè)定人血漿中奧司他韋和奧司他韋羧酸濃度的可靠性。2.關(guān)鍵詞奧司他韋和奧司他韋羧酸；流感；LC-MS/MS；血漿濃度3.引言流行性感冒（以下簡(jiǎn)稱流感）是流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，流感病毒屬于正粘病毒科，為單股、負(fù)鏈、分節(jié)段RNA病毒。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白不同，分為甲、乙、丙、丁四型。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。甲型和乙型流感病毒每年呈季節(jié)性流行，其中甲型流感病毒可引起全球大流行。全國(guó)流感監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，每年10月我國(guó)各地陸續(xù)進(jìn)入流感冬春季流行季節(jié)。流感的治療主要包括對(duì)癥治療以及抗病毒治療，抗病毒藥物主要包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑、血凝素抑制劑、M2離子通道阻滯劑等。神經(jīng)氨酸酶抑制劑對(duì)甲型、乙型流感均有效[1]。磷酸奧司他韋是流感神經(jīng)氨酸酶抑制劑，經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為活性成分奧司他韋羧酸鹽，抑制流感神經(jīng)氨酸酶，從而阻斷子代病毒顆粒的釋放。該藥適用于2周齡及以上的患者出現(xiàn)癥狀2天內(nèi)的急性簡(jiǎn)單流感的治療和1周歲以上人群的流感預(yù)防。推薦劑量為成人及青少年（13歲以上）每次75mg，每日2次，持續(xù)5天。

磷酸奧司他韋是其活性代謝產(chǎn)物的藥物前體，其活性代謝產(chǎn)物（奧司他韋羧酸鹽）是強(qiáng)效的選擇性的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。神經(jīng)氨酸酶是病毒表面的一種糖蛋白酶，其活性對(duì)新形成的病毒顆粒從被感染細(xì)胞中釋放和感染性病毒在人體內(nèi)進(jìn)一步播散至關(guān)重要。同時(shí)也有報(bào)道指出神經(jīng)氨酸酶對(duì)病毒進(jìn)入未感染細(xì)胞也具有一定作用。4.實(shí)驗(yàn)部分4.1儀器和試藥島津公司UPLC-30A超高效液相系統(tǒng)，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司TripleQuad-5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配ESI（電噴霧離子源）。鹽酸奧司他韋和奧司他韋羧酸標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)源：TLCPharmaceuticalStandards，批號(hào)：RS210604、4496-011A3；奧司他韋-d3/奧司他韋羧酸-d3（內(nèi)標(biāo)），來(lái)源：TLCPharmaceuticalStandards，批號(hào)：2556-054A3、2556-098A10；乙腈（Merck），HPLC級(jí)；甲醇（Merck），HPLC級(jí)；甲酸（Dikma），HPLC級(jí)；超純水（MilliporeMilli-Q），實(shí)驗(yàn)室自制。血漿由湖南益陽(yáng)康雅醫(yī)院提供。4.2分析條件液相條件：色譜柱為ACEExcel5C182.1*50mm，柱溫35℃，流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液-乙腈，流速0.4mL/min，進(jìn)樣體積4μL。質(zhì)譜條件：ESI（電噴霧離子源），正離子檢測(cè)，其中離子電壓控制在5500V，去集簇電壓70V，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）方式定量，奧司他韋313.2→225.1，奧司他韋羧酸285.2→138.1，奧司他韋-d3316.2→228.2，奧司他韋羧酸–d3288.3→138.1。4.3溶液的配制精密稱取奧司他韋和奧司他韋羧酸對(duì)照品，用適量的甲醇溶解，使用校正因子，分別配制成濃度為1mg/mL的奧司他韋和奧司他韋羧酸儲(chǔ)備液。將奧司他韋和奧司他韋羧酸依次配制成25.0/100、50.0/200、150/600、800/3200、1600/6400、6000/24000、9000/36000和10000/40000ng/mL溶液。取奧司他韋-d3和奧司他韋-d3對(duì)照品，用適量的甲醇溶解，配制成濃度為1.mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液IS-A，用甲醇溶液稀釋至200/1000ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液IS?C[1-5]。2.4血漿樣品處理取血漿樣品490μL，加入奧司他韋和奧司他韋羧酸對(duì)照品系列溶液10μL，配制成相當(dāng)于奧司他韋和奧司他韋羧酸血漿濃度為0.500/2.00，1.00/4.00，3.00/12.0，16.0/64.0，32.0/128，120/480，180/720，200/800ng/mL的血漿樣品，依次加入內(nèi)標(biāo)工作液IS?C10

μL（200

ng/mL），390μL的甲醇溶液，渦旋5min，在4000rpm、4℃條件下離心5分鐘，使用移液工作站移取上清液100μL至96孔板中，加入200μL甲醇：水（1:9）溶液稀釋，渦旋3分鐘，在4000rpm、4℃條件下離心5分鐘后進(jìn)行分析。5方法與結(jié)果蛋白沉淀法提取分析物和內(nèi)標(biāo)，采用反相色譜柱將奧司他韋和奧司他韋羧酸和內(nèi)標(biāo)從生物基質(zhì)中分離，使用串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀的電噴霧離子化方式（ESI）對(duì)分析物進(jìn)行定量分析。取空白血漿100mL，按2.4“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，通過(guò)分析物/內(nèi)標(biāo)的峰面積比值進(jìn)行回歸分析。奧司他韋和奧司他韋羧酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足方法驗(yàn)證的線性要求，且標(biāo)準(zhǔn)樣品滿足方法驗(yàn)證的相關(guān)接受標(biāo)準(zhǔn)。奧司他韋標(biāo)準(zhǔn)樣品的批間準(zhǔn)確度偏差在-3.80%和11.67%之間，批間精密度在1.44%和4.51%之間；奧司他韋羧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的批間準(zhǔn)確度偏差在-4.50%和11.67%之間，批間精密度在1.90%和3.95%之間。色譜圖由analystTM軟件1.6.3版自動(dòng)采集。用分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比和標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程（使用加權(quán)最小二乘法，權(quán)重因子1/x2），軟件自動(dòng)計(jì)算濃度。經(jīng)驗(yàn)證，1.本專題考察了6個(gè)不同來(lái)源空白人血漿，分別配制了空白樣品（不含分析物和內(nèi)標(biāo)的處理過(guò)的基質(zhì)樣品）、內(nèi)標(biāo)空白樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理過(guò)的基質(zhì)樣品）、定量下限；此外使用不同來(lái)源空白人血漿的混合基質(zhì)配制內(nèi)標(biāo)空白樣品和不含內(nèi)標(biāo)的奧司他韋/奧司他韋羧酸定量上限樣品及混合空白基質(zhì)加入單個(gè)待測(cè)物（不加其它待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)）的定量上限樣品。在6個(gè)不同來(lái)源空白人血漿樣品中未檢測(cè)到奧司他韋、奧司他韋羧酸或內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)空白樣品中未檢測(cè)到奧司他韋和奧司他韋羧酸、不含內(nèi)標(biāo)的奧司他韋/奧司他韋羧酸定量上限樣品中未檢測(cè)到內(nèi)標(biāo)，僅含待測(cè)物奧司他韋（不加待測(cè)物奧司他韋羧酸及內(nèi)標(biāo)）的定量上限樣品未檢測(cè)到奧司他韋羧酸及內(nèi)標(biāo)，僅含待測(cè)物奧司他韋羧酸（不加待測(cè)物奧司他韋及內(nèi)標(biāo)）的定量上限樣品未檢測(cè)到奧司他韋及內(nèi)標(biāo)。結(jié)果表明不同來(lái)源的基質(zhì)對(duì)奧司他韋和奧司他韋羧酸的測(cè)定不存在干擾，且奧司他韋、奧司他韋羧酸以及內(nèi)標(biāo)之間也不存在相互干擾。本方法未見顯著進(jìn)樣殘留；2.連續(xù)測(cè)定3天，考察3個(gè)分析批次，每批次各考察考察了奧司他韋和奧司他韋羧酸高、中、幾何中、低4個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6個(gè)樣品。奧司他韋和奧司他韋羧酸高、中、幾何中、低4個(gè)濃度質(zhì)控樣品批內(nèi)準(zhǔn)確度偏差在-6.57%到13.33%之間，批內(nèi)精密度在0.94%到5.56%之間，批間準(zhǔn)確度偏差在-3.88%到8.67%之間，批間精密度在2.97%到4.08%之間。3.奧司他韋高、中、低3個(gè)濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.13%、94.22%、91.89%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為89.53%，奧司他韋羧酸高、中、低3個(gè)濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.54%、95.87%、91.46%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為88.83%，表明在本方法的定量范圍內(nèi)奧司他韋和奧司他韋羧酸具有足夠、相對(duì)均一的提取回收率，且內(nèi)標(biāo)具有較高的回收率。4.溶血效應(yīng)、高脂效應(yīng)考察了人血漿溶血現(xiàn)象在高、低濃度質(zhì)控樣品（每個(gè)濃度4個(gè)樣品）中奧司他韋真實(shí)濃度的影響。提取后溶血樣品、高脂樣品的準(zhǔn)確度的真實(shí)值在±15%之內(nèi)且精密度%CV≤15%，均滿足相應(yīng)的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明人血漿溶血現(xiàn)象對(duì)奧司他韋血漿樣品真實(shí)濃度無(wú)影響。溶血效應(yīng)、高脂效應(yīng)考察了人血漿溶血現(xiàn)象在高、低濃度質(zhì)控樣品（每個(gè)濃度4個(gè)樣品）中奧司他韋羧酸真實(shí)濃度的影響。提取后溶血樣品、高脂樣品的準(zhǔn)確度的真實(shí)值在±15%之內(nèi)且精密度%CV≤15%，均滿足相應(yīng)的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明人血漿溶血現(xiàn)象對(duì)奧司他韋羧酸血漿樣品真實(shí)濃度無(wú)影響[3]。6小結(jié)本方法中，鹽酸奧司他韋和奧司他韋羧酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品使用K2-EDTA為抗凝劑的人血漿配制，奧司他韋-d3和奧司他韋羧酸-d3分別作為奧司他韋和奧司他韋羧酸的內(nèi)標(biāo)。采用蛋白沉淀法從100L血漿中提取分析物和內(nèi)標(biāo)，采用反向色譜柱將奧司他韋和奧司他韋羧酸和內(nèi)標(biāo)從生物基質(zhì)中分離，并使用串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀的電噴霧離子化方式（ESI）對(duì)分析物進(jìn)行定量分析。經(jīng)驗(yàn)證的奧司他韋的線性定量范圍為0.500ng/mL~200ng/mL，奧司他韋羧酸的線性定量范圍為2.00ng/mL~800ng/mL。本研究對(duì)測(cè)定人血漿中奧司他韋和奧司他韋羧酸的LC?MS/MS法進(jìn)行了全面方法驗(yàn)證。方法驗(yàn)證結(jié)果證明了本方法對(duì)于測(cè)定人血漿中奧司他韋和奧司他韋羧酸濃度的可靠性。此方法的選擇性、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、耐用性、定量下限、溶血效應(yīng)、高脂效應(yīng)及全血穩(wěn)定性均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)[1].流行性感冒診療方案(2020年版)[J].中國(guó)病毒病雜志,2021,11(01):1-5.DOI:10.16505/j.2095-0136.2020.0085[2].磷