DB50T 1044-2020 無菌(Germ-free,GF)豬微生物學(xué)監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30B40/49DB502020-10-10發(fā)布重慶市市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB50/T1044—2020 2 32規(guī)范性引用文件 33術(shù)語和定義 34妊娠母豬微生物學(xué)監(jiān)測 45無菌豬微生物學(xué)監(jiān)測 46飲水和日糧微生物學(xué)監(jiān)測 67隔離器和物品微生物學(xué)監(jiān)測 71DB50/T1044—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由重慶市畜牧科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：重慶市畜牧科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：葛良鵬、孫靜、梁浩、劉作華、丁玉春、吳夢、黃勇。2DB50/T1044—2020無菌（Germ-free,GF）豬微生物學(xué)監(jiān)測技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了無菌豬生產(chǎn)及使用過程中的妊娠母豬、無菌豬、飲水和日糧、隔離器和物品等微生物學(xué)監(jiān)測技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于無菌豬生產(chǎn)和使用時(shí)微生物學(xué)質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB16551豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范GB/T18090-2008豬繁殖與呼吸綜合診斷方法GB/T18448.1-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體外寄生蟲檢測方法GB/T18448.2-2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲檢測方法GB/T18641偽狂犬病診斷技術(shù)GB/T18935-2003口蹄疫診斷技術(shù)GB/T21674-2008豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法SN/T1559-2010非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T1919-2016豬細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范NY/T544-2015豬流行性腹瀉診斷技術(shù)NY/T548-2015豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)NY/T678豬偽狂犬病免疫酶試驗(yàn)方法NY/T679豬繁殖與呼吸綜合癥免疫酶試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語與定義適用于本文件。3.1無菌豬Germ-free(GF)pig利用現(xiàn)有檢測手段，無可檢出一切活的微生物（包括細(xì)菌、病毒）和寄生蟲，能保證豬源性細(xì)胞、組織、器官研究的生物安全性和清晰的微生物背景的實(shí)驗(yàn)用豬，簡稱無菌豬。3.2悉生豬Gnotobitoic(GN)pig以無菌豬為對(duì)象，通過微生物移植技術(shù)構(gòu)建出只含有特定菌群，并始終在可屏蔽外界微生物條件下生活的實(shí)驗(yàn)用豬，可分為單一菌株移植悉生豬和組合菌群移植悉生豬。3DB50/T1044—20203.3隔離環(huán)境Isolationenvironment與外界完全隔離，可阻斷任何外源微生物侵入的封閉空間。3.4屏障環(huán)境Barrierenvironment屏障環(huán)境應(yīng)作為隔離環(huán)境的第一層保障，用于放置和使用無菌隔離器。4妊娠母豬微生物學(xué)監(jiān)測妊娠豬應(yīng)未注射豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗，外觀健康、無異常；應(yīng)排除經(jīng)胎盤垂直傳播的四種疾病，包括豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病。病原篩查方法參照GB/T16551、GB/T18641、NY/T679和SN/T1919-2016執(zhí)行。5無菌豬微生物學(xué)監(jiān)測5.1采樣5.1.1采樣管的準(zhǔn)備宜采用螺帽蓋的采樣管，內(nèi)部自帶1支拭子。也可通過帶螺帽蓋的離心管和1支棉簽自制而成。采樣管選擇在保質(zhì)期內(nèi)的、且包裝完好的無菌采樣管（宜經(jīng)過環(huán)氧乙烷滅菌處理或提前高溫高壓滅菌處理。采樣當(dāng)天，無菌采樣管放入屏障設(shè)施的傳遞窗內(nèi)，并紫外光照30min及以上。5.1.2采樣管轉(zhuǎn)入隔離器在保持無菌豬飼養(yǎng)隔離器傳遞通道內(nèi)部密封罩密封狀態(tài)下，取下傳遞通道外側(cè)密封罩，將無菌采樣管放入傳遞通道，密封外側(cè)密封罩。采用1.5%-2%新制的過氧乙酸從傳遞通道外側(cè)密封罩上的消毒孔，對(duì)傳遞通道內(nèi)部空間進(jìn)行噴霧消毒。噴霧時(shí)間不宜低于5min。密封消毒孔，并等待30min以上。通過無菌豬飼養(yǎng)隔離器操作手套，從隔離器內(nèi)部取下傳遞通道內(nèi)側(cè)密封罩，將無菌采樣管移入隔離器內(nèi)，重新罩上傳遞通道的內(nèi)側(cè)密封罩。5.1.3采樣過程根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求用拭子采集樣本（如豬肛門拭子、鼻拭子或新鮮糞便立即裝回采樣管，并蓋緊螺帽蓋。5.1.4采樣管轉(zhuǎn)出隔離器取下傳遞通道內(nèi)部密封罩，將采樣管轉(zhuǎn)到隔離器的傳遞通道內(nèi)部，罩好內(nèi)部密封罩，再打開隔離器傳遞通道的外部密封罩，將采樣管取出，重新罩上外部密封罩。采用1.5%-2%新制的過氧乙酸從傳遞通道外部密封罩上的消毒孔，對(duì)傳遞通道內(nèi)部空間進(jìn)行噴霧。噴霧時(shí)間宜不少于5min。5.2細(xì)菌監(jiān)測4DB50/T1044—20205.2.1培養(yǎng)及觀察將采集的樣本分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，分別在需氧和厭氧條件下37℃培養(yǎng)48h及以上。無菌條件下，取培養(yǎng)后的樣本，涂片、固定、革蘭染色后顯微鏡下檢查菌體及形態(tài)。每個(gè)隔離器，宜平行檢測重復(fù)3次。5.2.2判定標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基上，應(yīng)無任何可見菌落；液體培養(yǎng)基內(nèi)，應(yīng)無渾濁、無沉淀，且鏡檢無細(xì)菌菌體。5.2.3監(jiān)測頻率宜每周檢測1次。5.3真菌監(jiān)測5.3.1培養(yǎng)及觀察將采集的樣本接種于大豆酪蛋白固體培養(yǎng)基，分別在20℃、28℃和37℃下需氧培養(yǎng)48h及以上。每個(gè)隔離器，宜平行檢測重復(fù)3次。5.3.2判定標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基上，應(yīng)無任何可見菌落，且鏡檢無真菌菌體。5.3.3監(jiān)測頻率宜每周檢測1次。5.4無菌豬病毒監(jiān)測5.4.1監(jiān)測指標(biāo)應(yīng)對(duì)4種垂直傳播病毒進(jìn)行監(jiān)測，包括豬瘟病毒、細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒。應(yīng)對(duì)5種豬常見病毒進(jìn)行監(jiān)測，包括口蹄疫病毒O、豬圓環(huán)-2型病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、非洲豬瘟病毒。5.4.2指標(biāo)檢測標(biāo)準(zhǔn)無菌豬的9種病毒指標(biāo)及其檢測標(biāo)準(zhǔn)見表1。表19種病毒指標(biāo)及檢測標(biāo)準(zhǔn)病毒指標(biāo)檢測標(biāo)準(zhǔn)豬瘟病毒GB/T16551-2008豬繁殖與呼吸綜合征病毒按照GB/T18090-2008豬細(xì)小病病毒SN/T1919-20165DB50/T1044—2020豬偽狂犬病病毒NY/T678-2003豬圓環(huán)-2型病毒GB/T21674-2008豬口蹄疫病毒OGB/T18935-2003豬流行性腹瀉病毒NY/T544-2015豬傳染性胃腸炎病毒NY/T548-2015非洲豬瘟病毒SN/T1559-20105.4.3判定標(biāo)準(zhǔn)上述9種病毒不應(yīng)檢出。5.4.4監(jiān)測頻率宜每月檢測1次。5.5無菌豬寄生蟲監(jiān)測5.5.1監(jiān)測指標(biāo)對(duì)豬弓形蟲、豬血虱、豬疥螨3種豬寄生蟲指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測。5.5.2指標(biāo)檢測方法豬弓形蟲檢測按照GB/T18448.2-2001執(zhí)行，豬血虱、豬疥螨按照GB/T18448.1-2001執(zhí)行。5.5.3判定標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)檢出任何寄生蟲。5.5.4監(jiān)測頻率宜每周檢測1次。6飲水和日糧微生物學(xué)監(jiān)測6.1飲水微生物學(xué)監(jiān)測6.1.1采樣與培養(yǎng)無菌條件下，取冷卻的滅菌純水1mL，接種到大豆酪蛋白固體培養(yǎng)基，分別在28℃和37℃需氧培養(yǎng)24h。宜平行檢測重復(fù)3次。6DB50/T1044—20206.1.2判定標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)檢出任何細(xì)菌。6.2日糧微生物學(xué)監(jiān)測6.2.1采樣與培養(yǎng)按照日糧總量的5%進(jìn)行抽樣檢查。無菌條件下，每袋無菌豬日糧取25g，加入25mL滅菌水，充分混勻，靜置10min。取上清液1mL，分別接種到大豆酪蛋白固體培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，在分別在需氧和厭氧條件下37℃培養(yǎng)72h及以上。無菌條件下，取培養(yǎng)后的樣本，涂片、固定、革蘭染色后鏡檢。宜平行檢測重復(fù)3次。6.2.2判定標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)檢出任何細(xì)菌。7隔離器和物品的微生物學(xué)監(jiān)測7.1隔離器的微生物學(xué)監(jiān)測7.1.1隔離器檢測前的準(zhǔn)備隔離器的準(zhǔn)備按照CQDB2018-0005要求進(jìn)行。準(zhǔn)備完成后并運(yùn)行24h以上，利用無菌拭子對(duì)隔離器內(nèi)部表面擦拭采樣，裝管密封后無菌傳出。7.1.2培養(yǎng)超凈工作臺(tái)內(nèi)，將采樣拭子分別接種到大豆酪蛋白固體培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，分別在需氧條件下28℃和37℃培養(yǎng)72h及以上。無菌條件下，取培養(yǎng)后的樣本，涂片、固定、革蘭染色后鏡檢菌體。7.1.3判定