《煙草及煙草制品 植物甾醇的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》技術(shù)報(bào)告

《煙草及煙草制品中植物甾醇的測(cè)定高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》技術(shù)報(bào)告1前言植物甾醇是植物性甾體化合物，它不僅是植物細(xì)胞的重要組成成分，也是一種重要的植物活性成分，其基本結(jié)構(gòu)為環(huán)戊氫化菲體系[1]。目前煙草中已報(bào)道植物甾醇主要有膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和-谷甾醇，霉變煙葉中還可能含有麥角甾醇[2,3]。除游離態(tài)甾醇外，甾醇類化合物還以結(jié)合態(tài)存在，結(jié)合態(tài)包括與脂肪酸結(jié)合成酯、與糖類的羥基形成糖苷鍵的配糖類物質(zhì)，以及?；涮穷惢衔颷4,5]。有研究對(duì)152個(gè)隨機(jī)選擇的煙草樣品中植物甾醇的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其含量范圍在0.1–0.3％之間[6]。煙草中植物甾醇主要存在于細(xì)胞膜中，不但能促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，而且對(duì)煙草的安全、品質(zhì)都有較大的影響。有研究表明煙草中的甾醇是卷煙煙氣致癌物多環(huán)芳烴的主要前體物，卷煙煙氣中61％的苯并[a]芘是由它裂解產(chǎn)生的[7-10]。不同于食品和其它植物中的甾醇，在卷煙抽吸時(shí)約有20％～25％的煙草植物甾醇完整的轉(zhuǎn)移到主流和側(cè)流煙氣中，甾醇中的羥基，高溫?zé)峤鈺r(shí)會(huì)與其母體的四輪環(huán)戊烯[]菲環(huán)結(jié)構(gòu)形成稠環(huán)芳烴化合物[11,12]。Stedman[13]的研究表明豆甾醇在750℃下熱解生成苯并[]芘；Badger等[14,15]的研究表明，在豆甾醇的裂解過(guò)程中，發(fā)生了甾醇骨架的一系列單分子反應(yīng)后形成了菲、蒽等多環(huán)芳烴。由于煙草中植物甾醇是卷煙煙氣中苯并[]芘生成的前體化合物[7]，對(duì)煙草及其制品中的植物甾醇進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，全面了解煙草中甾醇的存在形態(tài)、含量和分布情況，獲得其對(duì)卷煙煙氣中苯并[]芘釋放量的影響，對(duì)促進(jìn)卷煙的減害降焦研究具有重要的參考價(jià)值。目前我國(guó)還沒(méi)有煙草及其制品中植物甾醇含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，而卷煙降焦減害研究工作的深入對(duì)煙草中植物甾醇的準(zhǔn)確測(cè)定提出了需求，迫切需要準(zhǔn)確測(cè)定煙草及其制品中植物甾醇的標(biāo)準(zhǔn)方法。國(guó)內(nèi)外對(duì)植物甾醇的分析方法進(jìn)行了廣泛研究。由于甾醇一般存在于復(fù)雜的食品或植物的脂類中，要準(zhǔn)確測(cè)定植物甾醇的含量，需經(jīng)過(guò)萃取分離，純化富集、定量檢測(cè)等分析步驟[16,17]。其中，植物組織或含油的種子中分離植物甾醇一般采用溶劑萃取、柱層析、固相萃取、超臨界萃取或超臨界流體分餾后，對(duì)純化物進(jìn)行定量分析。植物甾醇定量方面，目前主要采用反相(正相)高效液相色譜柱色譜、薄層色譜、毛細(xì)管電色譜、氣相色譜。檢測(cè)器多使用氫離子火焰檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、紅外檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，復(fù)雜基質(zhì)中植物甾醇的分析方法有了非常大的發(fā)展[18]。煙草及其制品中植物甾醇的測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道主要有：Jiu等[19]研究了GC/MS/MS定量測(cè)定游離植物甾醇的方法，煙草甾醇被提取后就可直接進(jìn)樣分析。許燕娟等[20]采取三氯甲烷萃取煙草中的甾醇類物質(zhì)，取上層清液過(guò)濾后直接進(jìn)樣，氫火焰離子化檢測(cè)器測(cè)定了煙草中四種主要的甾醇，前處理方法十分簡(jiǎn)單。黃龍等[21]建立了一種采用二氯甲烷提取、微孔濾膜過(guò)濾、氣相色譜/質(zhì)譜/選擇離子監(jiān)測(cè)(GC/MS/SIM)定量測(cè)定煙草中游離植物甾醇的方法，該法適合批量煙葉樣品中甾醇的定量分析。張駿松[22]等研究了以丙酮為提取劑、三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷作衍生化劑，毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定煙草中的甾醇,取得滿意結(jié)果。劉少民等[16]采用濃鹽酸水解、KOH乙醇溶液皂化、正己烷萃取、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化和氣相色譜法測(cè)定了不同種類、不同品種、不同產(chǎn)地、不同部位煙葉樣品中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的甾醇。上述方法均采用氣相色譜分析，前處理方法主要有兩種，提取液直接進(jìn)樣和衍生化。由于甾醇類物質(zhì)沸點(diǎn)很高，如果不經(jīng)衍生化，樣品容易在色譜升溫過(guò)程中分解，故提取液直接進(jìn)樣重現(xiàn)性差。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“GB25223-2010-T動(dòng)植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定”采用的是衍生化氣相色譜法，但衍生化樣品前處理操作非常麻煩。液相色譜法也是植物甾醇測(cè)定的常用方法。由于甾醇紫外吸收很弱，紫外檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)需衍生化；用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可直接檢測(cè)甾醇，但選擇性差，對(duì)于基體復(fù)雜的樣品無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離[18]。由于煙草屬于基體復(fù)雜的樣品，所以這些方法難以在煙草甾醇測(cè)定中得到實(shí)際應(yīng)用。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)不僅檢測(cè)靈敏度高，還可通過(guò)兩級(jí)選擇離子獲得很高的選擇性，是非揮發(fā)性成分定量、定性測(cè)定的有效手段，該技術(shù)也廣泛用于植物甾醇分析[18,23,24]。采用LC-MS/MS法可不經(jīng)過(guò)衍生化直接測(cè)定煙草及其制品中的游離甾醇。與衍生化氣相色譜法相比，樣品前處理大大簡(jiǎn)化。由于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀在煙草煙草行業(yè)已逐步普及，具備了方法推廣應(yīng)用的條件，而且液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定甾醇方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，在其它樣品甾醇測(cè)定中得到廣泛應(yīng)用、方法成熟、測(cè)定結(jié)果可靠。在綜合考慮各種文獻(xiàn)報(bào)道方法和其它國(guó)家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，項(xiàng)目將建立用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定煙草及其制品中游離甾醇(膽甾醇、豆甾醇、-谷甾醇、麥角甾醇和胡蘿卜甙)的方法，并在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立相關(guān)的煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。圖1植物甾醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式(1)6-酮膽甾烷醇(2)胡蘿卜甙(3)麥角甾醇(4)膽甾醇(5)豆甾醇(6)β－谷甾醇2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑API4000QTRAP質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；WatersAcquity超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q50超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；；BT224S電子天平（感量0.1mg，德國(guó)Sartorius公司）。除特別要求外，均應(yīng)使用色譜純?cè)噭?，水?yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)定。試劑標(biāo)準(zhǔn)品包括：麥角甾醇（ergosterol），純度≥99%；膽甾醇（cholesterol），純度≥95%，豆甾醇（stigmasterol），純度≥95%；β－谷甾醇（β-sitosterol），純度≥98%；谷甾醇-3-O-葡萄糖苷/胡蘿卜甙（beta-Sitosterol-3-O-glucoside），純度≥92.9%；6-酮膽甾烷醇（6-Ketocholestanol），純度≥98%，均購(gòu)自加拿大Chromadex

公司。2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制2.2.1植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稱取5mg（精確至0.1mg）胡蘿卜甙、麥角甾醇、膽甾醇、和β－谷甾醇、豆甾醇至10mL容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，再用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成濃度均為0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在2～8℃下保存可儲(chǔ)存3個(gè)月。一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別準(zhǔn)確移取麥角甾醇、胡蘿卜甙、膽甾醇、豆甾醇和β－谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.0、1.0、1.0mL至25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。配制成麥角甾醇、胡蘿卜甙、膽甾醇、豆甾醇和β－谷甾醇濃度分別為10、20、20、20、20g/mL的一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。該溶液置于2～8℃下保存，有效期為3個(gè)月。2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稱取5.0mg的6-酮膽甾烷醇至10mL容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，甲醇定容至刻度。在2～8℃下保存，有效期3個(gè)月。一級(jí)內(nèi)標(biāo)溶液移取1mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為20.0μg/mL的一級(jí)內(nèi)標(biāo)溶液。該溶液于2～8℃條件下保存，有效期為3個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別移取0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0mL植物甾醇一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置于6個(gè)的25mL容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入0.2mL一級(jí)內(nèi)標(biāo)溶液。用萃取溶液定容至刻度，配制成6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。內(nèi)標(biāo)濃度為160ng/mL。若樣品濃度超出標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度范圍，可適當(dāng)擴(kuò)展工作溶液覆蓋范圍。萃取溶液移取8mL一級(jí)內(nèi)標(biāo)溶液置于1000mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度。配制成含內(nèi)標(biāo)160ng/mL的甲醇萃取溶液。2.3樣品分析2.3.1樣品的制備根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“YC/T31-1996煙草及煙草制品試樣的制備和水分測(cè)定烘箱法”的方法制備試樣。2.3.2樣品前處理稱取0.2g（精確至0.1mg）試樣于100mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入40.0mL萃取溶液，振蕩萃取2.0h后，靜置5min。取1mL萃取液過(guò)0.22μm濾膜，移至色譜分析瓶后立即進(jìn)樣分析。2.4參考的液相色譜、質(zhì)譜條件和目標(biāo)分析物保留時(shí)間依據(jù)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的儀器性能，優(yōu)化色譜、質(zhì)譜參數(shù)，實(shí)現(xiàn)分離與鑒定的最佳結(jié)合。以下參數(shù)作為相同型號(hào)儀器分析參考，采用不同儀器分離鑒定前應(yīng)進(jìn)行條件優(yōu)化，以提高方法的精密度和靈敏性。2.4.1超高效液相色譜條件——色譜柱：C18柱（1.7μm，2.1×100mm）或等效柱；本項(xiàng)目研究使用WatersAcquityUPLCBEHC181.7μm，2.1×100mm分析柱；——流速：0.4mL/min；——柱溫：40℃；——進(jìn)樣量：5μL；——流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：去離子水；——梯度洗脫條件如表1所示。表1超高效液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間min流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%095.05.06.0100.007.5100.008.095.05.012.095.05.02.4.2普通高效液相色譜條件——色譜柱：C18柱（5.0μm，3.9×150mm）或等效柱；本項(xiàng)目研究使用WatersXTerraRPC185μm，3.9×150mm分析柱；——流速：0.4mL/min；——柱溫：40℃；——進(jìn)樣量：5μL；——流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：去離子水；——梯度洗脫條件如表2所示。表2普通型高效液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間min流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%098.02.010.0100.0011.098.02.015.098.02.02.4.3質(zhì)譜參考條件——離子源：大氣壓化學(xué)電離源（APCI）；——掃描方式：正離子掃描；——檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；——電噴霧電壓：5500V；——離子源溫度：650℃；——輔助氣Gas1壓力：60psi；——輔助氣Gas2壓力：70psi；——各分析物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表4。表3質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)表分析物定量離子對(duì)m/zDPVCEVCXPV定性離子對(duì)m/zDPVCEVCXPV麥角甾醇379.5/69.328394.0379.5/159.2283915.0膽甾醇369.3/147.237339.0369.3/161.337329.0豆甾醇395.5/83.141364.0395.5/147.3383715.0β－谷甾醇397.5/161.324299.0397.5/147.224299.0胡蘿卜甙397.5/147.224299.0397.5/161.324299.06-酮膽甾烷醇403.4.4/385.3441610403.4/367.4502010.0注：DP，CE，CXP分別為去簇電壓、碰撞能量和碰撞池電壓2.5煙草及煙草制品中游離甾醇的定性和定量測(cè)定將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次分析進(jìn)樣，得到每個(gè)目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比及濃度比，根據(jù)峰面積之比和濃度之比繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，相關(guān)系數(shù)大于等于0.99。定性分析：每種被測(cè)組分選擇1個(gè)母離子，2個(gè)或2個(gè)以上子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)。將樣品譜圖中各組分特征離子的相對(duì)豐度與濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的特征離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，當(dāng)相對(duì)豐度＞50%時(shí)，允許偏差±20%；當(dāng)相對(duì)豐度在20~50%時(shí)，允許偏差±25%；當(dāng)相對(duì)豐度在10~20%時(shí)，允許偏差±30%；當(dāng)相對(duì)豐度＜10%時(shí)，允許偏差±50%。定量分析：煙草及煙草制品中五種游離甾醇的含量由式（1）計(jì)算得出：……（1）式中：X——樣品中游離甾醇的含量，單位為微克每克（μg/g）；C——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到游離甾醇濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；v——樣品萃取液定容體積，單位為毫升(mL)；m—試樣質(zhì)量，單位為克(g)；取兩次平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值作為測(cè)定結(jié)果，精確至0.01μg/g。兩次平行測(cè)定結(jié)果之間的相對(duì)偏差應(yīng)不大于10.0％。3結(jié)果與討論3.1內(nèi)標(biāo)的選擇液質(zhì)聯(lián)用定性分析多采用內(nèi)標(biāo)法。選擇同系物作為內(nèi)標(biāo)物，由于它們的化學(xué)性質(zhì)基本相同，可以最大限度地減少因?yàn)闃悠窊p失造成的分析誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇同系物內(nèi)標(biāo)法定量，查閱大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)6-酮膽甾烷醇不僅在結(jié)構(gòu)上與待測(cè)物有類似的在保留時(shí)間和定量方面都具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，且不是煙草及煙草制品的固有成分。故確定6-酮膽甾烷醇作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)來(lái)進(jìn)行定量。3.2不同萃取方式的選擇選取具有代表性的樣品分別進(jìn)行振蕩2h和回流萃取30min。如表6所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，振蕩的萃取2h的效率與回流萃取30min效率相當(dāng)，考慮到回流萃取操作繁瑣、且不能批量處理樣品，故選擇振蕩萃取作為樣品的萃取方式。圖2不同萃取方式的萃取效率（μg/g）3.3萃取溶劑的選擇為考察不同溶劑對(duì)游離甾醇的萃取情況，選取了甲醇、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷對(duì)樣品進(jìn)行振蕩萃取，并在相同條件下進(jìn)行分析。結(jié)果表明，甲醇萃取體系得到的色譜圖峰型分離較好。故采用甲醇作為萃取溶液。圖3不同萃取體系的比較3.4稱樣量穩(wěn)定性和萃取溶劑體積選擇分別取同一個(gè)樣品0.2、0.3、0.4、0.5g，分別加入20、30、40和50mL甲醇萃取溶液進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，從圖4現(xiàn)無(wú)論從甾醇含量還是穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)，每次實(shí)驗(yàn)的樣品量控制在0.2g，都能達(dá)到良好的穩(wěn)定性，隨著樣品量的增加無(wú)論萃取效率和穩(wěn)定性均沒(méi)有明顯差異或改善，其變異系數(shù)都在12%以下。考慮到稱樣量少于0.2g，不能反映整體，多于0.2g會(huì)對(duì)離子源造成一定的污染，故本實(shí)驗(yàn)選取0.2g稱樣量。圖4不同稱樣量下的變異系數(shù)從圖5中可以看出，固定樣品取樣量為0.2g時(shí)，加入40mL萃取溶劑能夠達(dá)到相對(duì)完全的萃取效果，因此本實(shí)驗(yàn)樣品量選0.2g，萃取溶劑體積選40mL。圖5萃取溶劑體積的選擇3.5振蕩萃取時(shí)間的選擇對(duì)同一樣品分別振蕩萃取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4h進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，振蕩萃取2.0h以后，四種甾醇的萃取效率均達(dá)到穩(wěn)定。最終選擇萃取時(shí)間2.0h。圖6不同振蕩萃取時(shí)間的萃取效率（μg/g）3.6離子源和電離方式的選擇在液質(zhì)連用中最常用的兩種接口方式就是APCI源和ESI源,ESI主要用于極性、大分子有機(jī)物，APCI一般用于弱極性、小分子有機(jī)物。文獻(xiàn)報(bào)道的甾醇分析方法既有用ESI源，又有用APCI源。為了獲取胡蘿卜甙、麥角甾醇、膽甾醇、β－谷甾醇和豆甾醇等五種甾醇和6-酮膽甾烷醇內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)，采用針泵進(jìn)樣，分別比較了ESI源和APCI源在正離子和負(fù)離子模式下的電離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是加乙酸銨，還是通過(guò)甲酸或乙酸進(jìn)行酸化，甾醇和內(nèi)標(biāo)都沒(méi)有分子離子峰產(chǎn)生。表4列出了ESI源和APCI源正離子模式下獲得的離子碎片，甾醇的質(zhì)譜圖見(jiàn)附錄。對(duì)于胡蘿卜甙、麥角甾醇、膽甾醇、β－谷甾醇和豆甾醇等不飽和甾醇，脫水[M+H-H2O]+是響應(yīng)最強(qiáng)的離子片段，而對(duì)于6-酮膽甾烷醇，[M+H]+是信號(hào)比較強(qiáng)的離子碎片。表4植物甾醇的離子碎片物質(zhì)分子量[M+H-H2O]+[M+H-2H]+[M+H]+[Aglycone+H-H2O]+胡蘿卜甙576.85397.5麥角甾醇396.63379.5395.3膽甾醇386.64369.3385.4β－谷甾醇412.69397.5413.2豆甾醇414.69395.5411.46-酮膽甾烷醇402.65385.3400.7403.4固定其它條件不變，比較了ESI離子源和APCI離子源對(duì)煙草中植物甾醇的離子化效果。結(jié)果如圖7所示，APCI相對(duì)于ESI來(lái)說(shuō)，選擇性較好，基質(zhì)干擾小，且信噪比低，說(shuō)明甾醇屬于小極性化合物，一般情況下不容易電離，需要通過(guò)電暈針?lè)劈c(diǎn)使其帶電。故測(cè)定時(shí)選擇APCI源來(lái)進(jìn)行離子化。圖7APCI源與ESI源的比較3.7液相色譜流動(dòng)相的選擇對(duì)同一樣品分別考察了流動(dòng)相A相為甲醇、乙腈；B相為水、乙酸銨水溶液、乙酸水溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。如圖8所示流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水的體系甾醇的響應(yīng)值最高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明在使用APCI源，電噴霧要求較低的揮發(fā)性緩沖鹽，在流動(dòng)相中加入乙酸銨、乙酸，抑制甾醇的有效地?fù)]發(fā)，使甾醇的響應(yīng)信號(hào)降低。為了提高甾醇的響應(yīng)度，故選擇甲醇-水體系作為流動(dòng)相。圖8不同濃度流動(dòng)相與響應(yīng)值(a:6-酮膽甾烷醇；b:胡蘿卜甙;c:膽甾醇；d:豆甾醇；e:β-谷甾醇)(1)甲醇-水體系（2）甲醇-乙酸水體系（3）甲醇-乙酸銨水體系3.8進(jìn)樣量的選擇APCI源要求較高流速才可以有更好的離子化效果，如果流速過(guò)低電暈針?lè)烹姛o(wú)法電離出足夠的電子或者質(zhì)子與樣品分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致靈敏度降低。用UPLC-MS/MS對(duì)同一樣品分別選取了5和10μL2個(gè)進(jìn)樣量進(jìn)行分析比較，結(jié)果如圖9所示。實(shí)驗(yàn)表明，色譜峰響應(yīng)值會(huì)隨著進(jìn)樣量的增加而增加，但隨著進(jìn)樣量的增加，色譜峰明顯展寬。因此，選擇5μL進(jìn)樣量。圖9樣品不同進(jìn)樣量與響應(yīng)值的TIC圖（1）5μL進(jìn)樣量；（2）10μL進(jìn)樣量；3.9色譜柱溫的選擇分別選取了30、40、50和60℃的柱溫對(duì)甾醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品進(jìn)行分析，如圖10所示。結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，溫度條件的差異對(duì)五種甾醇和內(nèi)標(biāo)的影響不大，40℃時(shí)響應(yīng)值稍高，故選擇40℃作為色譜分析柱溫。圖10不同的柱溫與響應(yīng)值3.10前處理后樣品的穩(wěn)定性分別采用白肋煙、香料煙、烤煙、混合型卷煙、烤煙型卷煙等五種不同類型樣品考察了處理后樣品的穩(wěn)定性。將前處理后的樣品密閉于色譜小瓶中，4℃冷藏保存，分別在當(dāng)天和2、3、4、5天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣。從表5的結(jié)果可見(jiàn)，隨著時(shí)間的增加，甾醇含量不是很穩(wěn)定。為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，建議當(dāng)天處理好的樣品當(dāng)天進(jìn)樣。表5放置時(shí)間與樣品穩(wěn)定性樣品天數(shù)胡蘿卜甙麥角甾醇膽甾醇豆甾醇β-谷甾醇香料煙1384.697.20118.94311.42184.242351.3210.11106.97393.47206.993429.839.96116.00391.61195.804398.439.15122.28315.15159.815445.537.63115.01268.53170.26RSD%9.27%15.14%4.93%16.29%10.35%烤煙1288.83——91.01375.11177.662299.73——103.18402.16205.273294.28——101.18351.67179.844272.48——108.99528.40178.385354.22——107.36400.36190.74RSD%10.26%——6.91%16.65%6.34%白肋煙1241.5520.87143.96578.87204.832268.6024.54154.98621.32200.973197.1020.68143.57590.45174.884229.9523.00145.31561.51176.235222.2222.42147.25696.58186.86RSD%11.30%7.16%3.18%8.73%7.31%混合型卷煙1257.76.——122.39452.51172.792238.66——108.83364.68155.423253.94——111.69414.32169.934299.76——132.32582.34161.535215.75——110.36420.05156.75RSD%12.18%——8.57%18.36%4.77%烤煙型卷煙1264.82——91.55287.01145.872254.94——95.73326.98156.583266.80——89.55312.44133.704268.77——106.99377.84151.865260.87——95.37336.42132.06RSD%2.08%——7.05%12.02%7.55%3.11標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限以甲醇:二氯甲烷（19:1）作為溶劑，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用內(nèi)標(biāo)法得到的5種植物甾醇的工作曲線線性良好，曲線參數(shù)和方法指標(biāo)如表6所示。其中檢出限和定量限分別取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)10次進(jìn)樣，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，由3倍和10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差得到。表65種甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和定量限、檢出限分析物回歸方程相關(guān)系數(shù)r檢出限μg/g定量限μg/g胡蘿卜甙Y=0.134x-0.07220.99993.2610.86麥角甾醇Y=0.134x+0.004410.99992.799.29膽甾醇Y=0.295x-0.4270.99942.909.65豆甾醇Y=0.063x-0.01210.99982.357.82β－谷甾醇Y=0.149x-0.01480.99972.247.463.12精密度和重復(fù)性為了考察方法的精密度，對(duì)同一樣品進(jìn)行5次日內(nèi)重復(fù)測(cè)定，結(jié)果如表7所示。結(jié)果表明，5種甾醇日內(nèi)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.87~9.84%之間，方法的精密度較好。表7方法的日內(nèi)重復(fù)性結(jié)果（μg/g）次數(shù)胡蘿卜甙麥角甾醇膽甾醇豆甾醇β－谷甾醇1363.648.21101.63262.94199.532337.536.75106.85290.91195.803382.288.41109.28322.61192.074359.917.59108.16341.26216.325376.698.09108.53305.83179.95平均值364.017.81106.89304.71196.74RSD4.78%8.51%2.87%9.84%6.70%采用所建立的檢測(cè)方法對(duì)同一個(gè)煙葉樣品進(jìn)行了5天的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8。結(jié)果表明，5種甾醇日間測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在3.81~9.05%之間，方法的日間重現(xiàn)性較好。表8方法的日間重復(fù)性結(jié)果（μg/g）天數(shù)胡蘿卜甙麥角甾醇膽甾醇豆甾醇β－谷甾醇1343.129.68108.34373.21187.492412.1210.25113.38353.29194.503371.1010.93113.94318.52192.744326.349.15122.28324.41185.285354.318.97110.21337.68176.45平均值361.409.80113.63341.42187.29RSD%9.058.254.716.523.813.13方法的回收率選取了白肋煙、香料煙、烤煙、混合型卷煙、烤煙型卷煙五種類型的煙葉或煙葉制品樣品，分別進(jìn)行了高、中、低三個(gè)水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果列于表9。回收率的均在90%以上。方法回收率較高。表9加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(添加量μg/g)樣品胡蘿卜甙麥角甾醇膽甾醇豆甾醇β-谷甾醇添加量回收率%添加量回收率%添加量回收率%添加量回收率%添加量回收率%白肋煙185.6291.3%27.6396.7%40.94111.4%208.42106.0%56.63108.2%281.32107.3%55.8494.5%62.0591.3%315.8895.0%114.4494.2%372.88109.7%83.2796.6%82.2493.6%418.6997.5%170.6491.1%香料煙186.44100.7%27.7591.5%41.1292.6%209.3597.3%56.88100.3%261.6492.0%51.9497.1%57.71101.8%293.7992.9%106.4391.4%363.0692.6%81.0792.2%80.08100.6%407.6693.7%166.15117.6%烤煙185.62104.5%26.5899.9%39.3894.6%200.4793.2%54.4799.4%281.32113.5%55.8494.3%62.05100.5%315.8890.5%114.4491.0%372.88119.2%83.194.6%82.0898.8%417.87106.2%170.31119.8%混合型卷煙177.2897.8%26.3998.9%39.1104.0%199.0690.6%54.09119.2%265.6891.6%52.7492.1%58.691.8%298.3294.6%108.07107.7%372.1594.0%83.1119.3%82.08101.0%417.8790.1%170.3197.6%烤煙型卷煙181.0199.3%26.9490.5%39.9290.8%203.25106.3%55.22104.0%269.58109.2%53.5193.3%59.46102.9%302.791.4%109.6691.0%367.9998.2%82.1796.9%81.1791.8%413.293.8%168.4196.0%3.14共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果本項(xiàng)目開(kāi)展了對(duì)比試驗(yàn)，選擇了香料煙、白肋煙、烤煙、烤煙型卷煙、混合型卷煙5種類型的卷煙進(jìn)行分析。選取了云南煙草科學(xué)研究院、紅塔集團(tuán)、紅云紅河集團(tuán)、國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、廣東中煙、江蘇中煙等6家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表10-表14所示。表10胡蘿卜甙共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/g）序號(hào)樣品云南院紅塔紅云質(zhì)檢中心廣東江蘇均值RSD1香料煙462.91455.01445.10448.88460.85452.87454.271.50%2白肋煙322.77321.79317.43298.80312.90298.95312.113.47%3烤煙359.48338.78317.46332.02330.04339.92336.284.14%4烤煙型卷煙354.28359.51332.51327.29318.72320.60335.495.18%5混合型卷煙340.47335.61340.92318.85322.67351.31334.973.64%表11麥角甾醇共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/g）序號(hào)樣品云南院紅塔紅云質(zhì)檢中心廣東江蘇均值RSD1香料煙10.249.8711.569.6210.1710.2810.296.53%2白肋煙26.5324.9924.1623.1122.4832.4724.5914.23%3烤煙————————4烤煙型卷煙————————5混合型卷煙————————表12膽甾醇共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/g）序號(hào)樣品云南院紅塔紅云質(zhì)檢中心廣東江蘇均值RSD1香料煙62.3176.0166.9774.1066.3463.7168.248.18%2白肋煙121.39135.74122.38125.90121.12124.50125.174.39%3烤煙63.1665.1663.1063.6461.2662.0663.062.13%4烤煙型卷煙60.7663.0161.5560.7361.4161.7861.541.36%5混合型卷煙61.7265.1168.6967.0678.6484.3470.9312.26%表13豆甾醇共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/g）序號(hào)樣品云南院紅塔紅云質(zhì)檢中心廣東江蘇均值RSD1香料煙324.86310.02316.89349.72325.72327.03325.714.13%2白肋煙521.91592.88600.00579.68599.60573.71577.965.10%3烤煙395.23394.37409.14419.48401.19446.10410.924.78%4烤煙型卷煙374.07370.61342.40345.12335.81356.44354.084.43%5混合型卷煙412.59410.45430.06452.51446.78426.27429.784.01%表14β－谷甾醇共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/g）序號(hào)樣品云南院紅塔紅云質(zhì)檢中心廣東江蘇均值RSD1香料煙195.91189.98199.80181.93197.91184.74191.713.82%2白肋煙204.48185.28191.63171.85191.63181.27187.695.89%3烤煙202.38189.67192.66173.16181.41179.25186.425.66%4烤煙型卷煙139.67147.56152.00128.81130.98132.39138.576.87%5混合型卷煙136.37133.77130.36129.07133.21142.24134.173.52%由表10-表14所示的結(jié)果可見(jiàn)，6家實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD除了2個(gè)為14.23%、12.26%之外，均小于10%，說(shuō)明各家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果較為接近，再現(xiàn)性好。3.15實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果采用優(yōu)化后的檢測(cè)方法對(duì)27個(gè)樣品進(jìn)行了測(cè)定，其中復(fù)烤煙葉樣品18個(gè)，卷煙樣品9個(gè)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表15。表15實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果（μg/g）樣品胡蘿卜甙麥角甾醇膽甾醇豆甾醇β－谷甾醇1#177.9796.93363.9894.252#202.0796.72352.33119.693#201.76112.24442.70136.344#238.00118.40506.00137.605#256.9699.70424.84127.286#287.78105.58424.01136.917#199.51113.06352.08115.408#239.04100.24285.30135.909#78.8064.24102.4641.8610#202.2692.60257.42118.6811#101.3284.43216.0751.9312#410.569.69165.02669.66175.5913#272.947.28114.15379.90113.2314#214.9710.56150.29633.4082.7315#403.037.81170.29556.29249.7616#333.338.02156.23487.18151.1017#251.5094.31288.49148.6818#282.6688.33334.73119.3919#240.41104.67321.78123.9020#415.7888.17365.66239.4421#227.50101.88354.10115.5322#299.90107.25387.29157.8923#278.9181.94273.71168.0424#328.47125.17344.02181.1525#299.6987.03301.48129.9226#334.757.57109.50323.40164.3527#229.9719.79135.91565.50177.57圖11典型混標(biāo)總離子流圖1、6-酮膽甾烷醇；2、胡蘿卜甙；3、麥角甾醇；4、膽甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇 圖12典型混標(biāo)提取離子流圖1、6-酮膽甾烷醇；2、胡蘿卜甙；3、麥角甾醇；4、膽甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇圖13典型樣品的總離子流圖1、6-酮膽甾烷醇；2、胡蘿卜甙；3、麥角甾醇；4、膽甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇圖14典型樣品的提取離子流圖1、6-酮膽甾烷醇；2、胡蘿卜甙；3、麥角甾醇；4、膽甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇圖15麥角甾醇二級(jí)質(zhì)譜圖(母離子379.5)圖16膽甾醇二級(jí)質(zhì)譜圖(母離子369.3)圖17豆甾醇二級(jí)質(zhì)譜圖(母離子395.5)圖18β－谷甾醇二級(jí)質(zhì)譜圖(母離子397.5) 圖19胡蘿卜甙二級(jí)質(zhì)譜圖(母離子397.5)圖206-酮膽甾烷醇二級(jí)質(zhì)譜圖(母離子403.4)參考文獻(xiàn)：[1]LenaNormen,SusanneBryngelsson,MonicaJohnsson.ThePhytosterolContentofSomeCerealFoodsCommonlyConsumedinSwedenandintheNetherlands[J].JOURNALOFFOODCOMPOSITIONANDANALYSIS,2002,15:693-704.[2]IrwinS,AnnelideP,HoffmannD．Phytosterolsintobacco：Quantitativeanalysisandfateintobaccocombustion[J]．BeitrfigezurTabakforSchuninternational.1975,8：211-218．[3]StedmanRL.Chemicalcompositionoftobaccoandtobaccosmoke[J].Chem.Rew.,1968,68l:53-207．[4]LiuWH,DingB,RuanXM，eta1.Analysisoffreeandconjugatedphytosterolsintobaccobyanimprovedmethodusinggaschromatography-flameionizationdetection[J].J.Chromatogr.A．2007,1163:304-311．[5]KovgankoNV,KashkanZN.Sterolglycosidesandacylglycosides[J]．Chem．Nat．Comp．1999,35：479-497．[6]左天覺(jué)．煙草的生產(chǎn)、生理和生物化學(xué)．上海遠(yuǎn)東出版社．1993．419—422．[7]SchepartzAI，EllingtonJJ，SehlotzhauerWS．Destructionofprecursorsofpolynucleararomatichydrocarbonsintobaccobytreatmentwithozone[J]．TohSci，1980，56：55-58．[8]FreudenthalRI，JonesPW.Carcinogenesis[M].NewYork：RavenPress，1976：225．[9]Schmeltz，HoffnlannD．Carcinogenesis，inFreudenthalRIandJonesPW(Editors),RaVenPress，NewYork，l976,225—230[10]Scholtzhauer，W.S，；SeVerson，R．F．；Chortyk，O．T．；Arrendale，R．F．；Higman，H．CPyrolyticfomationofpolynucleararomatichydrocarbonsfrompetroleumetherextractableconstituentsofflue．curedtobaccoleaf.J．Agric．FoodChem．1976，24，992—997．[11]Britt，P．F．；Buchanan，A．C．；Kidder，M．K．；Owens，C．V．Influenceofsteroidstructureonthepyrolyticformationofpolycyclicaromatichydrocarbons．J．Anal．App1．Pyro1．2003，66，7l-95．[12]Johnstone,R.A.W．；Plimmer,J.R．TheChemicalConstituentsofTobaccoAndTobaccoSmoke．Chem.Rev.1959，59，885-936[13]Bindler,G.N．；Piade,J.J．；Schulthess,D.EVaIuationofselectedstero