GBT-化學(xué)品 快速雄激素干擾活性報(bào)告試驗(yàn)及編制說(shuō)明

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)----GB/TGB/TXXXXX—XXXXII目 次前 言 II引 言 1122規(guī)范性引用文件 23術(shù)語(yǔ)?定義和縮略語(yǔ) 24試驗(yàn)原理 45受試物信息 46參比物 57儀器設(shè)備 58方法概述 59試驗(yàn)準(zhǔn)備 710試驗(yàn)過(guò)程 9試驗(yàn)的有效性 12數(shù)據(jù)與報(bào)告 A（資料性附錄）試驗(yàn)條件概述 15B（資料性附錄）最佳成像設(shè)置條件的確定校準(zhǔn) 16C（資料性附錄）收集胚胎：馴化和批量收集 20D（資料性附錄）日本青鳉胚胎孵化所需的培養(yǎng)基化學(xué)特性 21E（資料性附錄）鑒別正常與異常游離胚胎的拍攝方法 22F（資料性附錄）胚胎定位 23G（資料性附錄）試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法 24參 考 文 獻(xiàn) 26IIII前 言本文件按照GB/T1.1—2020?標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則?的規(guī)定起草?請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利?本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任?本文件由全國(guó)危險(xiǎn)化學(xué)品管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC251）提出并歸口?本文件起草單位：本文件主要起草人：PAGEPAGE1引 言本文件適用于快速評(píng)價(jià)受試物的雄激素干擾活性?本文件利用攜帶spg1-gfp遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因品系日本青鳉（Oryziasmedaka）的胚胎，在多孔板上測(cè)定受試物是否具有雄激素干擾活性，簡(jiǎn)稱試驗(yàn)（RapidAndrogenDisruptionReporterassay）?帶spg1-gfp基因遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因品系日本青鳉（O.latipes）作為受試生物，該遺傳構(gòu)建體包含與綠色熒光蛋白（GFP）的報(bào)告基因偶聯(lián)的spiggin1基因的啟動(dòng)子?Spiggin基因是一種糖蛋白（黏液狀膠質(zhì)蛋白）的編碼基因，該糖蛋白產(chǎn)自于性成熟的雄性三棘刺魚（Gasterosteusaculeatus）腎臟?本文件中使用的spg1-gfp轉(zhuǎn)基因品系在驅(qū)動(dòng)編碼序列表達(dá)的起始密碼子的上游攜帶4.159kb的三刺魚spggn1因動(dòng)本鳉三刺中的spggn1因具組特性spg1-gp轉(zhuǎn)基因品系完全復(fù)制了spiggin1的特性，因此僅限在腎臟（中腎）中特異性表達(dá)?文的的于定試在激軸是具潛活不為獲用風(fēng)評(píng)的毒性數(shù)據(jù)（例如：無(wú)觀察效應(yīng)濃度[NOEC]或效應(yīng)濃度X[ECX]）?本文件可用于指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）關(guān)于內(nèi)分泌干擾物試驗(yàn)框架的第3層級(jí)（OECD,第150號(hào)試驗(yàn)指南（GD150）中試驗(yàn)結(jié)果在類群間的解釋和外推（OECD,2018）?本文件只能采用spg1-gfp轉(zhuǎn)基因品系，如需使用基于spiggin1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)或報(bào)告基因的其他轉(zhuǎn)基因品系，則需要進(jìn)行完整的方法驗(yàn)證，以調(diào)整相關(guān)有效性標(biāo)準(zhǔn)?統(tǒng)計(jì)分析和熒光閾值?試的點(diǎn)誘單胚發(fā)熒對(duì)組比胚暴于試后激或制傳無(wú)17α-甲基-5α-二氫睪酮（17MT，3μg/L，作為AR激動(dòng)劑）的情況下對(duì)受試物進(jìn)行試驗(yàn)?由于胚胎階段產(chǎn)生的雄激素水平較低，因此可在暴露溶液中添加17MT，用于檢測(cè)對(duì)17MT可利用性有影響的試對(duì)AR現(xiàn)拮作的試17T度選驗(yàn)定合露的17T適度為3和5μg/L，所選濃度（3μg/L）對(duì)促雄激素和抗雄激素的參考受試物有最高的敏感度?化學(xué)品 快速雄激素干擾活性報(bào)告試驗(yàn)1 文定化品速激干活報(bào)試的語(yǔ)義縮語(yǔ)驗(yàn)理試信息?參比物?儀器設(shè)備?方法概述?試驗(yàn)準(zhǔn)備?試驗(yàn)過(guò)程?試驗(yàn)的有效性?數(shù)據(jù)與報(bào)告?文適于驗(yàn)評(píng)受物雄素?cái)_性于定試在有spg1-gp基品日本青鳉（Oryziaslatipes）胚胎中的熒光強(qiáng)度?本文件適用于不揮發(fā)或低揮發(fā)性?水溶性或非水溶性?能被精確測(cè)定的所有受試物?驗(yàn)，應(yīng)盡可能地對(duì)其成分進(jìn)行表征，例如，其成分的化學(xué)特性?定量情況和物質(zhì)特性?2 規(guī)范性引用文件列件的容過(guò)中規(guī)性用構(gòu)本件不少條款中日的用件，該期應(yīng)版適于文注期引文最版（括有修單用本文件?HJ1257-2022化學(xué)物質(zhì)環(huán)境管理化學(xué)物質(zhì)測(cè)試術(shù)語(yǔ)27850-2011化學(xué)品快速生物降解性21803-2008化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗(yàn)21856-2008化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗(yàn)21802-2008化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗(yàn)（Ⅰ）21831-2008化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗(yàn)21802-2008化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)21801-2008化學(xué)品快速生物降解性呼吸計(jì)量法試驗(yàn)GB/T27861-2011化學(xué)品魚類急性毒性試驗(yàn)No.23困難物質(zhì)和混合物的水生毒性試驗(yàn)指南（GuidanceDocumentonAquaticofSubstancesandMixtures）No.54生態(tài)毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法指導(dǎo)（CurrentApproachestheofAGuidanceApplication）3 術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)3.1 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件?3.1.1效應(yīng)濃度X theconcentrationgivinganeffectattheX%ofmaximumlevel(ECx）引起一組受試生物中的X%生物出現(xiàn)某觀察效應(yīng)的濃度?3.1.2游離胚胎eleutheroembryo胎化的命段在胎夠立食源食供之胚發(fā)的段本試中義日青胚從39發(fā)（化段第42發(fā)成獲物需結(jié)構(gòu)，包括上頜的牙齒?耳石和所有鰭的形狀）的發(fā)育階段?3.1.3最低可觀察效應(yīng)濃度thelowestobservedeffectconcentration(LOEC)在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，與對(duì)照組相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上對(duì)受試生物產(chǎn)生顯著效應(yīng)（p<0.05）的最低受試物濃度?3.1.4最大耐受濃度maximumtoleranceconcentration(MTC)受試物引起小于10%死亡率的最高受試物濃度?3.1.5無(wú)可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration(NOEC)在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，與對(duì)照組相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上對(duì)受試生物未產(chǎn)生顯著效應(yīng)（p<0.05）的最高受試物濃度?3.1.6加標(biāo)模式spikedmode在額外添加AR激動(dòng)劑（即濃度為3的17α-甲基-5α-二氫睪酮）的情況下進(jìn)行的快速雄激素干擾活性報(bào)告試驗(yàn)?3.1.7unspikedmode未額外添加AR激動(dòng)劑（即濃度為3的17α-甲基-5α-二氫睪酮）的情況下進(jìn)行的快速雄激素干擾活性報(bào)告試驗(yàn)?3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件?assay：快速雄激素干擾活性報(bào)告試驗(yàn)（RapidDisruptionReporterassay）GFP：綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein）17MT：17α-甲基睪酮（17α-Methyltestosterone）11KT：11-酮睪酮（11-Ketotestosterone）mDHT：17α-甲基-5α-二氫睪酮（17α-Methyl-5α-dihydrotestosterone）MS222:：甲磺酸三堿（Tricainemethanesulfonate）DMSO：二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide）dpf：受精后的天數(shù)（Daypostfertilisation）dph：孵化后的天數(shù)（Dayposthatch）AR：雄激素受體（AndrogenER：雌激素受體（EstrogenUVCB：不明復(fù)雜物質(zhì)（Substancesofunknownorcomposition,productsorOECD：經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OrganizationforCo-operationandDevelopment）GD：經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織指導(dǎo)文件（OECDguidancedocument）4 試驗(yàn)原理本試驗(yàn)方法利用攜帶spg1-gfp遺傳構(gòu)建題的轉(zhuǎn)基因品系日本青鳉（Oryziaslatipes）胚胎，檢測(cè)具spiggin1基因的啟動(dòng)子?在將受試生物暴露于受試物后，spg1基因的轉(zhuǎn)錄可能被激活或抑制，GFP報(bào)告基因隨之以不同程發(fā)熒此以過(guò)其光度測(cè)判受物否有激活性試是半態(tài)暴spg1-gfp17MT）聯(lián)合暴露的情況下（即“加標(biāo)模式”和“未加標(biāo)模式”），暴露于一定濃度范圍的受試物溶液少置個(gè)同度受物理及應(yīng)養(yǎng)和/溶照組動(dòng)對(duì)組?動(dòng)抗對(duì)組等試通采轉(zhuǎn)因spg1-gp鳉胎GP光像對(duì)光號(hào)的定量統(tǒng)計(jì)，以對(duì)具有雄激素活性的受試物的正確分類?5 受試物信息受試物的信息應(yīng)包括：a) 組物理觀溶和他關(guān)理學(xué)質(zhì)學(xué)識(shí)號(hào)IUACAS稱?性等（如適用，包括有機(jī)碳含量）?此外，還可包括光穩(wěn)定性?試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性?pKa?Kow?歸趨信息及其在試驗(yàn)系統(tǒng)中快速降解性等信息，例如，生物降解性試驗(yàn)的結(jié)果，參見(jiàn)27850-2011?化學(xué)品快速生物降解性通則?；b) 物理化學(xué)性質(zhì)；c) 受試物的定量分析方法，包括定量限值；d) 關(guān)于受試物穩(wěn)定性或溶解性的初步研究的現(xiàn)有數(shù)據(jù)或結(jié)果；e) 發(fā)波450500n（M=50–550nm熒的果及這波下示熒但在胚胎內(nèi)沒(méi)有熒光的結(jié)果?要了受物試介中溶性采有知確度靈性有分方法定量暴露溶液中的受試物，并報(bào)告分析效率和定量限?6 參比物在使用本文件之前，應(yīng)采用表1中列出的四種參比物以驗(yàn)證方法的有效性?表1mDHT、利谷隆、頭孢呋辛和色苷酸鈉參比物信息表參比物號(hào)類別試驗(yàn)濃度預(yù)期統(tǒng)計(jì)顯著性mDHT活性8,4,2,1μg/L4μg/L利谷隆活性2.5,mg/L1.25mg/L頭孢呋辛無(wú)活性1,0.1,mg/L無(wú)活性色苷酸鈉無(wú)活性μg/L無(wú)活性注預(yù)期的統(tǒng)計(jì)顯著性限值是指暴露于測(cè)定濃度的參比物處理組與對(duì)照相的熒光比值這些限值通過(guò)OCD的RDR試驗(yàn)驗(yàn)證確定7 儀器設(shè)備所需儀器設(shè)備如下：a)培養(yǎng)箱（或適當(dāng)?shù)臏囟扰c光照控制設(shè)備）；b)化學(xué)惰性材料制成的透明細(xì)胞培養(yǎng)6孔板；c)果下上察底透的色96板光像定量果上上察用色塑料表面熒光成像和定量；d)pHe)配備光源的體式顯微鏡（用于觀測(cè)受精卵/未受精卵）；f) 長(zhǎng)通濾光片和彩色照相機(jī)的熒光顯微鏡，用于熒光成像和定量（OECD，2022）；圖像分析軟件；h)適用于受試物的分析設(shè)備或外包分析服務(wù)?8 方法概述8.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)利用spg1-gfp17MT聯(lián)合暴露的情況下（即“加標(biāo)模式”和“未加標(biāo)模式”），在六孔板中暴露于受試物，三個(gè)重復(fù)，周期為72h?每次試驗(yàn)至少設(shè)置5個(gè)不同濃度的受試物處理組，以及相應(yīng)空白（培養(yǎng)基和/或溶劑）對(duì)照組?激動(dòng)劑對(duì)照組?激動(dòng)劑+拮抗劑對(duì)照組等?在半靜態(tài)暴露體系下，每個(gè)試驗(yàn)組（包括處理組和對(duì)照組）包括四個(gè)孔，每h和48組對(duì)組共同個(gè)板個(gè)理和照照設(shè)三重試驗(yàn)個(gè)復(fù)驗(yàn)要用280個(gè)胚胎，三個(gè)重復(fù)共需要840個(gè)胚胎?該試驗(yàn)通過(guò)熒光成像技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)基因spg1-gfp胚胎的GFP熒光，并完成熒光信號(hào)的定量統(tǒng)計(jì)?試驗(yàn)條件概述見(jiàn)附錄A?8.2試驗(yàn)對(duì)照試所對(duì)組有溶濃應(yīng)（適應(yīng)可不用機(jī)劑控最溶劑濃度為100mg/L（0.01%），選用溶劑二甲基亞砜（DMSO）時(shí)濃度不超過(guò)0.2%??a)空白（培養(yǎng)基和/或溶劑）對(duì)照組：4個(gè)孔，每孔5個(gè)胚胎暴露于空白中?該對(duì)照組用于確定空中熒強(qiáng)基果用他劑將組露液空換與它組度同溶介中某情下使的劑有用歷數(shù)據(jù)可需同設(shè)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組；b)317MTμg/L的17MT，用于確定17MT濃度為3μg/L時(shí)的熒光強(qiáng)度?如果需要設(shè)置下述的附加對(duì)照，則該組的結(jié)果可用于附加對(duì)照中17T準(zhǔn)線計(jì)可標(biāo)曲上出何有雄素應(yīng)受物17T量值（選做）；c)1017MT濃度為10μg/L的熒光強(qiáng)度?如果需要設(shè)置下述的附加對(duì)照，則該組的結(jié)果可用于附加對(duì)照中17T準(zhǔn)線計(jì)可標(biāo)曲上出何有雄素應(yīng)受物17T量值（選做）；d)317MT激動(dòng)劑+500μg/L氟酰胺拮抗劑對(duì)照組：4個(gè)孔，每孔5個(gè)胚胎，暴露于3μg/L的17MT和500μg/L的氟酰胺，用于與單獨(dú)使用17MT3μg/L的對(duì)照組對(duì)比，以確定500μg/L濃度酰的光制用果要置述附對(duì)照該的果用附對(duì)中酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算，并可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出作為AR拮抗劑的受試物的氟酰胺當(dāng)量值，用于任何在加標(biāo)模式（存在3μg/L的17MT）下表現(xiàn)出抗雄激素活性的受試物?于試結(jié)只證受物否有激效相的性此算述當(dāng)值是須的，該數(shù)據(jù)僅供參考?如果確定要計(jì)算相關(guān)當(dāng)量值，則每次需設(shè)置以下附加對(duì)照組?以下的附加對(duì)照組是選做的，建議用于實(shí)驗(yàn)室參數(shù)校準(zhǔn)以及質(zhì)量控制?a)1.5/L17T4孔孔5胚露于1.5/L的17T確定17T度為1.5μ/L時(shí)的熒光強(qiáng)度?該對(duì)照組可與317MT組和1017MT組共同用于計(jì)算17MT標(biāo)準(zhǔn)曲線?可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算用于誘導(dǎo)雄性激素軸信號(hào)的受試物的17MT當(dāng)量值；b)3μL17T167μL酰胺4孔孔5胚胎露于3μL17T和16μL氟酰胺?該對(duì)照組用于與單獨(dú)使用17MT3的對(duì)照組相比，確定167濃度氟酰胺的熒光抑制作用?該對(duì)照組可用于計(jì)算氟酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線；c)317MT+55.65317MT和55.6的氟酰胺?該對(duì)照組用于與單獨(dú)使用17MT3的對(duì)照組相比，確定55.6濃度氟酰胺的熒光抑制作用?該對(duì)照組可用于計(jì)算氟酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線；d)317MT+18.5氟酰胺：4個(gè)孔，每孔5個(gè)胚胎，暴露在3μg/L17MT和18.5的氟酰胺?該對(duì)照組用于與單獨(dú)使用17MT3的對(duì)照組相比，確定18.5濃度氟酰胺的熒光抑制作用?該對(duì)照組可用于計(jì)算氟酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線?果驗(yàn)使有溶有對(duì)組試組應(yīng)證有同度溶劑外照的試驗(yàn)結(jié)果需通過(guò)用于讀數(shù)的成像系統(tǒng)的有效性標(biāo)準(zhǔn)，如未通過(guò)，則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效?8.3試驗(yàn)平行整個(gè)試驗(yàn)包括三個(gè)獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，每次試驗(yàn)按照5個(gè)胚胎/孔，4孔/組的分配運(yùn)行（如圖1）?在添加或不添加17MT的情況下，受試物至少設(shè)置五個(gè)濃度處理組?每次試驗(yàn)必須使用相同的濃度，每次平使獨(dú)的液使在同次化胚依進(jìn)試驗(yàn)過(guò)合次行驗(yàn)果到試物的原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)，每個(gè)處理組共包括60個(gè)胚胎（n=60），因此可獲得60個(gè)熒光強(qiáng)度的量化數(shù)據(jù)?在次驗(yàn)顯陽(yáng)反的況不獨(dú)示個(gè)行的驗(yàn)果更確估每試組平均熒光值?

圖1試驗(yàn)概述9 試驗(yàn)準(zhǔn)備9.1受試生物試的試物純的spg1-g基品日青胚兩純的spg1-g本鳉配轉(zhuǎn)基因品系在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培育（見(jiàn)附錄spg1-gfp構(gòu)建體胚胎中可發(fā)出熒光時(shí)，可能還需要使用野生型胚胎來(lái)驗(yàn)證受試物是否在該胚胎中發(fā)出熒光?本文件的暴露試驗(yàn)從胚胎發(fā)育至0dph時(shí)期開(kāi)始（26°C約受精后10d）?雖然要求必須是0于同暴組想況實(shí)室自培胚者其實(shí)室取胎驗(yàn)始前盡可能延長(zhǎng)胚胎的適應(yīng)期，已達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)附錄日本青鳉的飼養(yǎng)?繁殖和護(hù)理在許多資料中都有描述，例如Medaka:Biology,Management,andExperimentaletal.,2009;et青鳉養(yǎng)殖指南?每一代spg1-gfp轉(zhuǎn)基因品系都應(yīng)該通過(guò)運(yùn)行全套完整的對(duì)照（包括附加對(duì)照）進(jìn)行驗(yàn)證，確保符合所有有效性標(biāo)準(zhǔn)，以及獲得17MT和氟酰胺對(duì)照的預(yù)期響應(yīng)曲線?年對(duì)機(jī)擇胚的育段行次量制查確試結(jié)時(shí)離胎發(fā)階段不高于第42期?9.2培養(yǎng)基養(yǎng)以是養(yǎng)本鳉胎見(jiàn)錄D礦水泉水木過(guò)的來(lái)?于同區(qū)水可有大異此進(jìn)水分以查能擾定果潛污（包重屬化物其在有于質(zhì)否合養(yǎng)本鳉歷數(shù)的況下別要意是和胺些學(xué)質(zhì)日青胚具毒性養(yǎng)中應(yīng)用合劑質(zhì)析支持日本青鳉正常生長(zhǎng)和發(fā)育并滿足試驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)介質(zhì)都適合作為培養(yǎng)基?9.3該試驗(yàn)使用的日本青鳉胚胎從發(fā)育至0dph時(shí)期開(kāi)始試驗(yàn)，到3dph時(shí)期（約第40期）結(jié)束試驗(yàn)?在試驗(yàn)之前或期間都不能喂食（Iwamatsu，2004）?胚胎的卵黃囊直到發(fā)育至第41/42期仍然存在，并作為青鳉胚胎發(fā)育的能量來(lái)源?9.4檢測(cè)受試物的潛在熒光試不用檢在發(fā)長(zhǎng)450500nλX=450500nm射長(zhǎng)500550n（M=500-550種特性的受試物可能會(huì)誘發(fā)熒光，并被誤解為GFP信號(hào)，導(dǎo)致受試物被錯(cuò)誤鑒定為對(duì)雄激素軸有活性?定試是在些長(zhǎng)發(fā)熒的法在9板的1孔分添加200L受物溶度本件理的高度后96板另10孔分添200L空介后用胚熒成和量同儀和置熒進(jìn)定過(guò)計(jì)析估白質(zhì)受物之間的潛在熒光強(qiáng)度差異?首先，進(jìn)行D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)?如果空白介質(zhì)和受試物的熒光數(shù)均合態(tài)布進(jìn)雙尾-驗(yàn)確兩的光值否統(tǒng)學(xué)具顯性異果其中一組或兩組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則應(yīng)進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)?如果確定了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，則應(yīng)在26±1°C的溫度下，將20個(gè)野生型日本青鳉胚胎暴露于這種熒光化學(xué)物質(zhì)72±2h，同時(shí)每天更換試溶后熒進(jìn)定將與相條下暴于白質(zhì)20野型胎熒光度行較照述計(jì)析法比白質(zhì)受物果者熒強(qiáng)值統(tǒng)學(xué)存顯性異認(rèn)該試是發(fā)熒的熒存于胎內(nèi)時(shí)文不用受物的測(cè)果試在加和標(biāo)式均誘熒存其被謝熒代物可這些情況下，應(yīng)檢查圖像以確定熒光是否僅限于腎臟?如果不是，則應(yīng)執(zhí)行上述暴露野生型胚胎的步驟，以確定該受試物是否代謝為熒光代謝物?9.5試驗(yàn)濃度的選擇9.5.1確定最高試驗(yàn)濃度大受TC在次獨(dú)復(fù)驗(yàn)次致死率不過(guò)10%受物最高試驗(yàn)濃度?應(yīng)使用日本青鳉胚胎進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定暴露濃度范圍，以評(píng)估可能的毒性?定露度圍預(yù)驗(yàn)至設(shè)三濃組度選一按何數(shù)列度隔系數(shù)不超過(guò)10倍?在選定的試驗(yàn)濃度和對(duì)照條件下，只需進(jìn)行一次試驗(yàn)（20個(gè)胚胎/組）?預(yù)試驗(yàn)可使用生或spg1-gp基胚5胚/的度每中加8mL暴溶個(gè)驗(yàn)和對(duì)組為4過(guò)合露相試濃或照所20胚的據(jù)算到/畸形）胚胎的百分比?暴露濃度范圍的確定中，設(shè)置的最高濃度必須導(dǎo)致10%以上的死亡率（和/或畸形），除非最高試驗(yàn)濃度已達(dá)到100mg/L或到達(dá)受試物最大溶解度?應(yīng)根據(jù)受試物在試驗(yàn)介質(zhì)中的溶解度限值?MTC?在胚胎中引起10%以上死亡率和/或畸形的最大濃度或100mg/L的最大濃度（以最低者為準(zhǔn)）等參考指標(biāo)確定受試物的最高試驗(yàn)濃度?9.5.2試驗(yàn)濃度范圍試要受物少五試濃并過(guò)效標(biāo)議個(gè)鄰驗(yàn)度間濃間隔（間隔系數(shù)）為9.5.3受試溶液試驗(yàn)的受試物，參考OECD發(fā)布的第23號(hào)關(guān)于難以試驗(yàn)受試物的水相水生毒性試驗(yàn)指導(dǎo)文件（OECD，2019b）?在可能的情況下，盡量不使用溶劑或限制最大溶劑濃度為100mg/L（0.01%）?如果確認(rèn)所使用的劑溶濃能滿所有性準(zhǔn)按OD23指文的述OD201b?這些有效性標(biāo)準(zhǔn)包括胚胎存活率和對(duì)照組的毒性?果用劑有驗(yàn)度和照中溶濃應(yīng)持致?lián)袢苁呛先∮谑茉囄锏奈锢砘瘜W(xué)特性和日本青鳉的敏感性，最好在預(yù)試驗(yàn)中確定?還應(yīng)考慮溶劑對(duì)生殖軸的潛在效應(yīng)（Hutchinson等，2006年）?重配一制對(duì)溶或驗(yàn)液得于同次驗(yàn)4°件儲(chǔ)的液在度達(dá)到26±1露溶液應(yīng)在試驗(yàn)的當(dāng)天配制并儲(chǔ)存在4°C的更新溶液進(jìn)行分析測(cè)量?10試驗(yàn)過(guò)程10.1暴露條件將胚胎暴露于化學(xué)惰性塑料的細(xì)胞培養(yǎng)六孔板中（通?？變?nèi)徑為34mm?高度208mL溶液，放置5個(gè)胚胎?在每次平行中，每個(gè)試驗(yàn)濃度下有20個(gè)胚胎?每個(gè)對(duì)照組包含20個(gè)胚胎?如果塑料孔板不適用于檢測(cè)特殊受試物，則替換為其他玻璃容器（如小直徑皮氏培養(yǎng)皿）?在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，胚胎在26±1°C的恒溫箱中孵育72±2h，并保持黑暗?這限制了不同培養(yǎng)箱間技差簡(jiǎn)了行驗(yàn)要求果用照期需特的長(zhǎng)強(qiáng)來(lái)制異性?這也是試驗(yàn)光敏受試物的優(yōu)點(diǎn)?在每次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，都應(yīng)準(zhǔn)備一套新的暴露溶液?PAGEPAGE1010.2分析檢測(cè)于用靜換方此記受物濃穩(wěn)性想況試的定應(yīng)許暴露濃度在24h內(nèi)保持在標(biāo)稱濃度的±20%內(nèi)?對(duì)分析試驗(yàn)的最低要求是科學(xué)上合理的最低樣本量?OECD第23號(hào)指導(dǎo)文件提供了相關(guān)指導(dǎo)(OECD，2019b)?更新暴露液的時(shí)間最長(zhǎng)為24±2h?如果在試驗(yàn)系統(tǒng)中不能維持濃度在±20%以內(nèi)，以慮短新期于度能持標(biāo)濃度80120%圍的試物許用量度的幾何平均值；詳見(jiàn)指導(dǎo)文件第235章(OECD，2019b)?10.3試驗(yàn)運(yùn)行a）第01) 在胚胎孵化當(dāng)天（0dph；受精后約10d；溫度為26°C）將其放入暴露液中；2) 在挑選胚胎時(shí)，觀察胚胎并將出現(xiàn)明顯畸形或身體損傷（如尾部損傷?水腫?脊柱側(cè)彎）的胚胎排除試驗(yàn)之外（見(jiàn)附錄E?收集健康外觀正常的胚胎至單的含有合適體積的培0dph時(shí)期健康和正常的游離胚胎數(shù)量低于80%，則認(rèn)定當(dāng)批次胚胎不適用于試驗(yàn)?在進(jìn)行試驗(yàn)之前，應(yīng)在移除死亡和畸形胚胎時(shí)確認(rèn)是否適用于試驗(yàn)；3) 驗(yàn)始用液將5胚轉(zhuǎn)至孔中除養(yǎng)基首添受物溶液?注意每次只處理一個(gè)孔板，以避免胚胎缺水?b）第1d2d24±1h和48±2h內(nèi)分別更換受試物溶液和對(duì)照組溶液?檢查每個(gè)孔內(nèi)是否有外觀異常（損傷?異常游泳行為等）的胚胎?移除死亡胚胎?明顯畸形或損傷的胚胎并實(shí)施安樂(lè)死，并記錄所有觀察結(jié)果?在每次試驗(yàn)中，如果在一個(gè)對(duì)照組或一個(gè)處理組中出現(xiàn)超過(guò)10%的累死率可察的致效未影的驗(yàn)度于個(gè)應(yīng)止驗(yàn)查導(dǎo)致死亡或異常的原因?c）第3d1)暴露72±2h后，對(duì)每個(gè)胚胎的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量?首先用8mL不含受試物的培養(yǎng)基更試溶液移死胚或顯形胚胎錄有察果果一對(duì)組一個(gè)處理組中出現(xiàn)超過(guò)10%的累積死亡率和可觀察到的亞致死效應(yīng)，而未受影響的試驗(yàn)濃度少五個(gè)應(yīng)止驗(yàn)查導(dǎo)死或常原因考對(duì)據(jù)常實(shí)組據(jù)行分析?如果需要對(duì)胚胎進(jìn)行麻醉后成像，則應(yīng)在六孔板中每孔加入2mL1的MS222（甲基磺酸三卡因）緩沖液；2) 建議在將胚胎進(jìn)行成像的所有情況前都進(jìn)行麻醉?只有當(dāng)它們?cè)谧杂捎蝿?dòng)時(shí)（如在96孔的中不使麻醉了免度醉應(yīng)醉個(gè)列可取生體量?要時(shí)醉始15in胚轉(zhuǎn)到于像支黑塑表或色96板后彩相和GP通光進(jìn)成像用準(zhǔn)程確的數(shù)拍到包括每個(gè)生物體腎臟在內(nèi)的背側(cè)區(qū)域圖像?d）終止試驗(yàn)讀熒強(qiáng)之每胚持暴于1/的S222沖至少20mn其進(jìn)行安樂(lè)死?11試驗(yàn)的有效性11.1熒光定量分析試依于每胚發(fā)的光度行化了?，F(xiàn)當(dāng)確定量開(kāi)預(yù)試展試是了準(zhǔn)光像統(tǒng)確設(shè)可取適態(tài)圍熒測(cè)細(xì)明附錄B）?如果使用替代的熒光測(cè)量系統(tǒng)，則應(yīng)按照熒光成像系統(tǒng)的詳細(xì)說(shuō)明（見(jiàn)附錄B）對(duì)其進(jìn)行校準(zhǔn)驗(yàn)過(guò)好用備相的光微鏡為樣便圖進(jìn)質(zhì)控制識(shí)定不的胎與激軸活關(guān)熒信（括光或維光學(xué)質(zhì)胚內(nèi)出光情況和異常的熒光模式）?11.2試驗(yàn)的有效性為了保證試驗(yàn)結(jié)果的有效性，每次運(yùn)行都應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，否則視為無(wú)效：a)空白對(duì)照組和1017MT對(duì)照組之間測(cè)量到的熒光強(qiáng)度之間應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?1017MT對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度值至少為空白對(duì)照組或溶劑對(duì)照組（如使用溶劑）的300%；b)在17MT存在和不存在的情況下，每個(gè)對(duì)照組和至少五個(gè)濃度處理組的死亡率和/或畸形率，及于胎位佳致無(wú)數(shù)附錄F總不超過(guò)10%符這標(biāo)的組得到的結(jié)果是無(wú)效的?了試有組復(fù)驗(yàn)整數(shù)應(yīng)足下準(zhǔn)則有個(gè)復(fù)結(jié)都視無(wú)a)1017MT對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度值應(yīng)至少比317MT對(duì)照組的高10%?這可確保17MT10組的平均熒光高于3組的平均熒光，歷史數(shù)據(jù)表明這對(duì)于確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性非常重要?通常，兩者之間的差異遠(yuǎn)大于10%；b)317MT對(duì)照組和317MT+500氟酰胺對(duì)照組之間的熒光抑制應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差c)于次復(fù)驗(yàn)次驗(yàn)至具五“據(jù)效組”試濃“據(jù)效組”鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下：如果三次重復(fù)試驗(yàn)（每次最好為20個(gè)胚胎）都通過(guò)了有效性標(biāo)準(zhǔn)（死亡率?和/畸率及于胎置附錄導(dǎo)的效據(jù)總不超過(guò)10%該處理組（最好為60個(gè)胚胎）可被視為“數(shù)據(jù)有效組”；d)果行圖質(zhì)控這有性準(zhǔn)用圖質(zhì)控之果察與效性標(biāo)準(zhǔn)有細(xì)微偏差，則應(yīng)考慮與試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性有關(guān)的結(jié)果，并將這些考慮因素包含在報(bào)告中?12數(shù)據(jù)與報(bào)告12.1數(shù)據(jù)處理在分析之前，應(yīng)從數(shù)據(jù)中刪除從位置不佳的胚胎圖像得到的熒光測(cè)量值（見(jiàn)附錄F）?每個(gè)處理組由于胚胎位置不佳導(dǎo)致的綜合死亡率和/或畸形率以及無(wú)效數(shù)據(jù)的總和不應(yīng)超過(guò)10%?使用合適的軟件處理胚胎的彩色圖像，提取GFP的熒光數(shù)值?開(kāi)源的處理軟件可選擇ImageJ或者新本的IJchnden201了除像的發(fā)（GP光議圖的?和顏層開(kāi)后綠層去色將色的加并綠層減著以得的像用度值減內(nèi)性素著成背干擾后所圖中有素?zé)煽偤瓦M(jìn)行量化?這項(xiàng)技術(shù)是一種有效限制測(cè)量相關(guān)的熒光僅出現(xiàn)綠層黃熒則時(shí)現(xiàn)綠和色中果減未倍紅層仍一內(nèi)性光根成系的同紅層倍是用據(jù)像統(tǒng)所熒過(guò)片不可以應(yīng)用其他技術(shù)來(lái)減少內(nèi)源性色素沉著對(duì)信號(hào)定量的影響?一旦證明圖像分析工作流程能夠滿足特定熒光成像系統(tǒng)的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)將其應(yīng)用于所有后續(xù)的試驗(yàn)?對(duì)于每個(gè)有效試驗(yàn)濃度處理組組和對(duì)照組，將來(lái)自三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)合并，以獲得54-60個(gè)熒光據(jù)多為60為個(gè)驗(yàn)件對(duì)的行20胚組驗(yàn)三重組5值的下限代表每次試驗(yàn)中10%的死亡率和/或畸形率，因此每次平行試驗(yàn)最低獲得18個(gè)熒光數(shù)據(jù)?行次立復(fù)驗(yàn)提試的定而三重可會(huì)生同結(jié)果這種況該定被為效有根整的據(jù)發(fā)受物有性觀到單濃響應(yīng)曲線的情況下，三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果才可相互比較?果試中用溶應(yīng)溶的在響行估體法對(duì)劑照和白照的計(jì)較果白照溶對(duì)之沒(méi)顯的計(jì)差異應(yīng)用合試介和劑照果三試中測(cè)空對(duì)組溶對(duì)組間在計(jì)上顯差異證試失單分每重試確溶在次復(fù)的果否重果著差的存在，證試失使新次溶或他劑行的驗(yàn)選劑否合有效標(biāo)也須到證果歷數(shù)表所溶在選度與白照比統(tǒng)學(xué)沒(méi)顯性異，則可能不需要設(shè)置空白對(duì)照組?12.2統(tǒng)計(jì)分析根OD第5文關(guān)?態(tài)性據(jù)計(jì)析現(xiàn)方：用南OD200年）使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法?一般而言，與對(duì)照相比，使用雙尾假設(shè)檢驗(yàn)法（p<0.05）分析受試物對(duì)誘發(fā)熒光的影響?推薦的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（已在實(shí)驗(yàn)室間的驗(yàn)證過(guò)程中進(jìn)行了評(píng)估）是通過(guò)D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)來(lái)確定每個(gè)暴露組的數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，然后，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則進(jìn)行檢驗(yàn)，后行ANOA驗(yàn)果據(jù)符正分違齊方假設(shè)進(jìn)行Krusal-s驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunn檢驗(yàn)（詳見(jiàn)附錄G?另外，也可使用嵌套ANOA分析（也稱混合ANOA分析）來(lái)分析這類數(shù)據(jù)，該方法帶有隨機(jī)效應(yīng)項(xiàng)，可反映每次平行或每個(gè)孔帶來(lái)的變異性?隨后可進(jìn)行Dunnett檢驗(yàn)等事后檢驗(yàn)，以確定差異的大小和顯著性?12.3決策邏輯文制了策輯程試和果讀供（圖示決邏基三有重試的總計(jì)析果加標(biāo)17T未標(biāo)17式下試至有個(gè)驗(yàn)度有活性，并且觀察到單調(diào)的濃度-響應(yīng)關(guān)系，則認(rèn)為該受試物呈陽(yáng)性結(jié)果?a) 17MT未加標(biāo)模式中，活性濃度的定義是：與溶劑對(duì)照相比，熒光強(qiáng)度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加的受試物濃度；b) 17T標(biāo)式性度定是3μL17T照相光度著加減少的受試物濃度?果察非調(diào)度應(yīng)應(yīng)過(guò)較次復(fù)驗(yàn)果確結(jié)的靠性果果可靠，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，可使用不同的濃度范圍，以驗(yàn)證結(jié)果（見(jiàn)圖2?如果結(jié)果可靠，則認(rèn)為該受試物對(duì)激軸有性果第次復(fù)驗(yàn)試中到同結(jié)果本件能適于受物，可能需要進(jìn)行替代試驗(yàn)?于胎育段以成檢的激水此未標(biāo)式不出熒下果在加模下察熒強(qiáng)在計(jì)上著低可表本件適于受物者物體?驗(yàn)件在在題要一調(diào)分單重試確三重中否在計(jì)上顯熒下后據(jù)業(yè)斷決是重復(fù)選不復(fù)次使一新胚進(jìn)一次重復(fù)試驗(yàn)；或者使用較低的濃度范圍進(jìn)行一次完整的試驗(yàn)；或者進(jìn)行不同的雄激素軸活性試驗(yàn)?圖2用于解釋試驗(yàn)結(jié)果的決策邏輯圖GD果熒光強(qiáng)度在未加標(biāo)模式下有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著下降，詳細(xì)描述見(jiàn)12.3?13試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下信息：13.1受試物該部分詳細(xì)信息見(jiàn)第5章?13.2受試生物a) 學(xué)名?轉(zhuǎn)基因品系?供應(yīng)商或來(lái)源以及培養(yǎng)條件?b) 試驗(yàn)前從批次中去除的死亡和畸形游離胚胎的百分比?13.3試驗(yàn)條件a) 驗(yàn)序例試的度溫?續(xù)間半態(tài)體?毫的胎量；b) 養(yǎng)性詳信考泉或水來(lái)處說(shuō)木過(guò)等使的工培養(yǎng)基及所做的任何測(cè)量；c) 備的制法更頻（使溶，提溶及濃信息；d) 用于暴露的六孔板和用于熒光成像和定量的所有孔板的品牌和參考信息；e) 用于定量的熒光顯微鏡的參考資料和設(shè)置?還應(yīng)提供用于圖像分析的方法?13.4結(jié)果討論a) 確定試驗(yàn)濃度范圍的結(jié)果，可用于確定MTC和/或?yàn)檫x擇用于正式試驗(yàn)的試驗(yàn)濃度；b)驗(yàn)度可的況下應(yīng)告確試容中試的度進(jìn)的有學(xué)析的暴露濃度；還應(yīng)報(bào)告分析方法的回收效率和定量限；c) 報(bào)告每次試驗(yàn)中死亡和畸形胚胎的數(shù)量，以及它們的所在組別和天數(shù)；d) 告光量始據(jù)如個(gè)光始據(jù)想況據(jù)以ab或csv式集，數(shù)?實(shí)驗(yàn)室名稱?游離胚胎批號(hào)和熒光值；e) 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和處理方法，包括所使用的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，以及是否和為何進(jìn)行數(shù)據(jù)審查；f) 所有有效性標(biāo)準(zhǔn)；) 個(gè)驗(yàn)括有照和試濃組熒平值其E（均的準(zhǔn)差，以圖像的形式表示，并與樣本量一起在表格中顯示；h) 在加標(biāo)和未加標(biāo)模式下，與其各自的對(duì)照組相比，每個(gè)濃度的熒光增加或減少的百分比；) 做在用情下供劑潛影的估果劑照與白照的計(jì)比較（如果包括在本文件中）或先前研究的結(jié)果；) 他觀到生效或量果告察或量的何他物如為?；虺Ｋ刂粚?duì)任何偏離試驗(yàn)或偏離有效性標(biāo)準(zhǔn)的解釋，以及對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的潛在后果的考慮；在適用情況下，討論在加標(biāo)和/或未加標(biāo)模式下發(fā)現(xiàn)的活性濃度；得出結(jié)論，表明受試物對(duì)雄激素軸上是有活性的還是無(wú)活性的?A（資料性附錄）試驗(yàn)條件概述表A.1 試驗(yàn)條件概述試驗(yàn)參數(shù)條件概述受試胚胎含的O.胚胎終點(diǎn)單個(gè)胚胎的熒光強(qiáng)度值暴露期03暴露時(shí)長(zhǎng)72h±2h暴露方法分別在暴露后24h和48h更換溶液，不喂食?pH暴露期間培養(yǎng)條件26±1?，暗每個(gè)濃度組的生物個(gè)體數(shù)量每孔5個(gè)胚胎（六孔板）x4個(gè)孔（每個(gè)濃度組共20個(gè)胚胎）培養(yǎng)基體積每孔8mL培養(yǎng)基水溶液，允許Oltps正常生長(zhǎng)和發(fā)育（參見(jiàn)92?試驗(yàn)次數(shù)用新配制的溶液對(duì)每種受試物進(jìn)行3次試驗(yàn)?選擇受試生物的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)育階段（0dh?胚胎健康（活的和無(wú)畸形?有效性標(biāo)準(zhǔn)在17MT10對(duì)于三次平行的試驗(yàn)組：17MT10觀察到1MT3μgL對(duì)照組的濃度-響應(yīng)關(guān)系（見(jiàn)1.?至少包含五?數(shù)據(jù)有效的試?數(shù)據(jù)有效?的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)為：驗(yàn)濃度?當(dāng)單次重復(fù)試驗(yàn)組的胚胎死亡率和畸形合并?1該試驗(yàn)濃度（20個(gè)生物體）被認(rèn)為在本次試驗(yàn)中是?數(shù)據(jù)有效組?當(dāng)三次重復(fù)中的每一次均被認(rèn)為?數(shù)據(jù)有效組時(shí)，該試驗(yàn)濃度被視?數(shù)據(jù)有效?對(duì)照組空白對(duì)照組17MT激動(dòng)劑對(duì)照組1M（3gL氟他（50gL）對(duì)照組空白對(duì)照組17MT激動(dòng)劑對(duì)照組1M（3gL氟他（50gL）B（資料性附錄）最佳成像設(shè)置條件的確定校準(zhǔn)準(zhǔn)目是然集驗(yàn)果成設(shè)不確所實(shí)室參物17T氟胺得相似的響應(yīng)程度和靈敏度?校準(zhǔn)的兩個(gè)步驟：1.確定最佳成像設(shè)置條件，使?jié)舛葹?0的17MT獲得合適的誘導(dǎo)結(jié)果?2.將這些設(shè)置應(yīng)用于17MT和氟他胺的三次濃度反應(yīng)試驗(yàn)，以通過(guò)使用增加的17MT和氟他胺濃度以及誘導(dǎo)可檢測(cè)的反應(yīng)的最低濃度的17MT或氟他胺來(lái)檢查誘導(dǎo)的幅度?下個(gè)驟述示操中有露液用0.2%二基（DSO作例使用替代溶劑進(jìn)行相同的試驗(yàn)操作?如果在進(jìn)行本文件試驗(yàn)時(shí)更換了溶劑，或首次試驗(yàn)時(shí)沒(méi)有使用溶劑，則校準(zhǔn)過(guò)程不需要重復(fù)?B.1選擇圖像拍攝設(shè)置一是校試確正的像攝置定的些置用后的驗(yàn)了擇圖像拍攝的設(shè)置，將50個(gè)胚胎暴露于50的17MT中，并按照以下方案調(diào)整設(shè)置?此步驟只需重復(fù)一次?B.1.1配制暴露溶液a) 試驗(yàn)組由10個(gè)孔組成，每孔5個(gè)spg1-gfp轉(zhuǎn)基因日本青鳉魚的胚胎；b) 所有孔中DMSO的最終濃度為0.2%；c) 5017MT的DMSO溶液；1) 將50的17MT溶液均分，每份200μL；2) 均分溶液在-20°C下保存，不超過(guò)2個(gè)月?d) 配制含有0.2%DMSO的5017MT的以下暴露溶液?1) 空白培養(yǎng)基1002) 含17MT50的DMSO100μL；3) DMSO100μL?B.1.2開(kāi)始暴露a) 向每個(gè)孔中添加5個(gè)spg1-gfp轉(zhuǎn)基因日本青鳉魚胚胎；b) 胚不水情下除大的體最剩體積800L；c) 每個(gè)孔添加8mL暴露溶液；d) 在黑暗中于26°C下孵育孔板?試驗(yàn)期間，禁止喂食?B.1.3在24h和48h更換暴露溶液a) 記錄死亡率，并移除所有死亡胚胎；b) B1.1配制暴露溶液；c) 去除最大體積的溶液；d) 每個(gè)孔添加8mL暴露溶液；在黑暗中于26°C下孵育孔板?試驗(yàn)期間，禁止喂食?B.1.472h時(shí)期潤(rùn)洗胚胎a) 準(zhǔn)備含有8水的六孔潤(rùn)洗板，可使每個(gè)孔中的胚胎正常生長(zhǎng)和發(fā)育；b) 將暴露組孔板中的所有胚胎轉(zhuǎn)移至潤(rùn)洗孔板中?B.1.572h時(shí)期觀察胚胎a) 必要六板每暴于50μL17T胚中入2mL度為1/L的S222用于麻醉?注意一次只能麻醉一塊孔板；b) 放置好胚胎，使成像系統(tǒng)可以對(duì)背側(cè)進(jìn)行成像；c) 調(diào)整熒光顯微鏡的變焦和聚焦，以確定允許兩個(gè)腎臟成像的最大變焦；d) 檢查孔板上的其他胚胎，以確保所選的縮放使兩個(gè)腎臟在同一幅圖像中顯示?否則，則重新調(diào)整縮放，重新開(kāi)始該過(guò)程；e) 如果可能，重置相機(jī)的白平衡；f) 將相機(jī)的增益設(shè)置為零，并調(diào)整曝光時(shí)間，調(diào)整到腎臟盡可能明亮而不顯白；) 果光要置在100s上導(dǎo)致GP號(hào)（GP號(hào)的色域增加增益并重新啟動(dòng)；h) 檢查孔板上的其他胚胎，以確保選定的暴露時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致腎臟的很大一部分變白?否則，則重新調(diào)整縮放，重新開(kāi)始該過(guò)程；保存并記錄相機(jī)的選定設(shè)置，并保存設(shè)置文件，以便在以后的每次成像過(guò)程中調(diào)用；拍攝每個(gè)胚胎的圖像；拍攝完所有圖像后，對(duì)胚胎進(jìn)行安樂(lè)死；按照第12章的說(shuō)明對(duì)圖像進(jìn)行分析；m)暴露于雄激素后的胚胎的示例圖像（背側(cè)視圖）見(jiàn)附錄F?B.217MT和氟他胺的線性和靈敏度確定17MT和氟他胺的線性和靈敏度?在317MT存在的情況下，將20個(gè)胚胎暴露于一定濃度范圍的17MT和一定濃度范圍的氟他胺中?該步驟需要三次獨(dú)立重復(fù)?B.2.1配制暴露溶液a) 每個(gè)試驗(yàn)組由4個(gè)孔組成，每孔5個(gè)spg1-gfp轉(zhuǎn)基因日本青鳉魚胚胎；b) 所有孔中DMSO的最終濃度為0.2%；c) 1017MT的DMSO溶液；-將1017MT溶液均分，每份溶液為200μL；-均分的溶液在-20°C下保存，不超過(guò)2個(gè)月?d) 500氟他胺溶于DMSO的溶液?-將500氟他胺溶液均分，每份溶液200-將均分的溶液在-20°C下保存，不超過(guò)2個(gè)月?根據(jù)以下內(nèi)容配制試驗(yàn)溶液：溶液名稱最終濃度準(zhǔn)備的中間體混合溶液最終體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)基無(wú)mL培養(yǎng)基+DMSO20溶劑對(duì)照無(wú)70含0.1%DMSO的70mLDMSO4517MT100.1%DMSO無(wú)mL培養(yǎng)基+17517MT10mg/L3517MT3無(wú)90mL17MT100.1%DMSO+含0.1%DMSO的μL培養(yǎng)基1017MT101050含0.1%DMSO的50mL17MT10+505017MT33含0.1%DMSO的mL17MT3+4517MT5025mL17MT3+25mL溶劑對(duì)照50氟他胺70含0.1%DMSO的70mL17MT3+70μL氟他胺mg/L45氟他胺7525mL氟他胺+50mL17MT350氟他胺55.655.67525mL氟他胺+50mL17MT350氟他胺18.518.57525mL氟他胺55.6+50mL17MT75表B.1試驗(yàn)溶液和中間溶液的配制B.2.2試驗(yàn)組為：

溶劑對(duì)照：含0.2%DMSO的培養(yǎng)基含0.2%DMSO的17MT1.5含0.2%DMSO的17MT3含0.2%DMSO的17MT10氟他胺18.5+含0.2%DMSO的17MT3氟他胺55.6+含0.2%DMSO的17MT3氟他胺167+含0.2%DMSO的17MT3氟他胺500+含0.2%DMSO的17MT3B.2.3開(kāi)始暴露a) 在每孔添加5個(gè)spg1-gfp轉(zhuǎn)基因胚胎；b) 胚不水情下除大積液（大余積800μ；c) 繼續(xù)處理對(duì)照組?17MT17MT+氟他胺組；d) 每個(gè)孔添加8mL暴露溶液；e) 在黑暗中于26°C下孵育孔板?試驗(yàn)期間，禁止喂食?B.2.3.1在24h和48h更新暴露液a) 記錄死亡率，并移除所有死亡胚胎；b) B2.1配制暴露溶液；c) 使用軟移液管移除最大體積的液體；d) 每個(gè)孔添加8mL暴露溶液；e) 在黑暗中于26°C下孵育孔板?試驗(yàn)期間，禁止喂食?B.2.3.2在72h潤(rùn)洗胚胎a) 準(zhǔn)備六孔潤(rùn)洗板，每孔含有脫氯水或礦泉水；b) 將暴露組的所有胚胎從暴露板轉(zhuǎn)移到潤(rùn)洗板；c) 將潤(rùn)洗板運(yùn)送至將進(jìn)行讀數(shù)的位置?B.2.3.3在72h觀察胚胎a) 加載第一步校準(zhǔn)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)保存的圖像拍攝參數(shù)；b) 有要六板每中入2mL度為1/L的S222醉露溶對(duì)溶的胚胎；c) 注意一次只能麻醉一塊孔板；d) 如果需要，在麻醉開(kāi)始后（1至5in，將胚胎轉(zhuǎn)移到用于成像的載體上，如黑色塑料表面或透明底部黑色96孔板；e) 放置好胚胎，以便成像系統(tǒng)可以對(duì)背側(cè)進(jìn)行成像；f) 拍攝每個(gè)胚胎的圖像；在拍攝暴露組的所有圖像后，對(duì)胚胎進(jìn)行安樂(lè)死；h) 繼續(xù)拍攝，直到完成所有組的拍攝；i) 按照第12章的說(shuō)明分析圖像?B.2.4結(jié)果分析a) 匯總數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，應(yīng)注意17MT和氟他胺的最低b) 17MT的應(yīng)至少為3μg/L，氟他胺的至少為500μg/L；c) 17MT和氟他胺應(yīng)在濃度試驗(yàn)范圍內(nèi)應(yīng)呈現(xiàn)濃度-響應(yīng)關(guān)系；d) 如果由于低濃度時(shí)靈敏度低或較高濃度時(shí)信號(hào)飽和，和濃度-響應(yīng)關(guān)系不明顯，則應(yīng)盡量調(diào)整圖像拍攝參數(shù)以改善濃度-響應(yīng)關(guān)系?PAGEPAGE20C（資料性附錄）收集胚胎：馴化和批量收集驗(yàn)需胎遲在驗(yàn)始前3d集便復(fù)適應(yīng)接胚到露始間內(nèi)死亡或異常胚胎數(shù)量少于總數(shù)的20%時(shí)，才可收集該批胚胎?試驗(yàn)開(kāi)始前三天收集胚胎方法：a) 不同受精日期的胚胎不得混用；b) 對(duì)胚胎進(jìn)行分類，以去除死亡和異常胚胎且應(yīng)少于20%，否則該批次不適用于本文件試驗(yàn)；c) 正胚轉(zhuǎn)到1L體器或15cm養(yǎng)中養(yǎng)中有合養(yǎng)本鳉胎培基見(jiàn)錄D；d) 每個(gè)晶體容器的最大密度為500個(gè)胚胎，每個(gè)培養(yǎng)皿的最大密度是200個(gè)胚胎；e) 約26溫和14h10h光周下育胎據(jù)要整化度制胎在9dpf或10dpf期右化佳胚在712dpf間化符實(shí)開(kāi)要求；f) 試驗(yàn)所需胚胎為0dph時(shí)期胚胎，但允許0dph時(shí)期胚胎有不同的受精天數(shù)?在單次重復(fù)試驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)胚胎的受精天數(shù)差異不應(yīng)超過(guò)一天?應(yīng)隨機(jī)選用胚胎到不同暴露組中；在胚胎發(fā)育至孵化期間，胚胎培養(yǎng)基應(yīng)至少更換一次?D（資料性附錄）日本青鳉胚胎孵化所需的培養(yǎng)基化學(xué)特性表D.1適合青鳉胚胎孵化的培養(yǎng)基參數(shù)要求指標(biāo)推薦范圍允許范圍脫氯-必要的顆粒過(guò)濾25推薦活性炭過(guò)濾-推薦電導(dǎo)率溫度26??亞甲基藍(lán)每升培養(yǎng)基添加的1儲(chǔ)備液推薦pH必要的注1如果要使用人工培養(yǎng)基推薦使用一種經(jīng)OCD國(guó)際實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證的人工培養(yǎng)基然后用反滲透水稀釋10倍培養(yǎng)基儲(chǔ)備液以獲得1x的工作溶液，并用1N的NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至之間。其中10倍培養(yǎng)基儲(chǔ)備液成分包括：a) NaCl 5b) c) d) 0.15e) NaOH1N 1.25mL/L注2:除了人工培養(yǎng)基，青鳉胚胎還可以在玻璃瓶裝礦泉水、泉水、井水或木炭過(guò)濾的自來(lái)水或任何支持青鳉正常生長(zhǎng)和發(fā)育的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。E（資料性附錄）鑒別正常與異常游離胚胎的拍攝方法圖E.1識(shí)別正常和異常胚胎的拍攝方法(A常離胎常胎括B胎小度顯同次其胚短(C分化胚尚完從中出D和E發(fā)不，化青胚都現(xiàn)非大卵囊但呈形；(F)畸形，尾巴向下彎曲?比例尺為1GB/TGB/TXXXXX—XXXXPAGEPAGE23F（資料性附錄）胚胎定位圖用于成像的胚胎的預(yù)期定位如果胚胎的位置允許對(duì)背側(cè)區(qū)域（包括腎臟的位置）進(jìn)行成像，則該定位是正確的?圖F.1A)和B）為兩個(gè)spg1-gfp青鳉胚胎背側(cè)圖像，胚胎腎臟中顯示綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)?胚胎朝向圖像的右側(cè)?G（資料性附錄）試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法采用的統(tǒng)計(jì)方法首先要進(jìn)行D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)以確定每個(gè)暴露組的數(shù)據(jù)否正分?確方是均，進(jìn)方齊檢（如Levne驗(yàn)?果據(jù)正分且違方齊假應(yīng)未標(biāo)式的試處組空對(duì)（未用劑劑照試介對(duì)行ANOA驗(yàn)后行Dunettspost-hoc檢驗(yàn)?同樣，應(yīng)對(duì)加標(biāo)模式下的受試物處理組和17MT3μg/L對(duì)照進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunnett’spost-hoc檢驗(yàn)?如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差非齊次，則應(yīng)執(zhí)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后執(zhí)行Dunnett’spost-hoc或Welchsl多對(duì)一比較檢驗(yàn)?果據(jù)符正分應(yīng)未標(biāo)式的試處組空對(duì)（未用劑劑照試介對(duì)行Krska-Walis驗(yàn)后行Dunet’spos-hc檢驗(yàn)?同樣，應(yīng)對(duì)加標(biāo)模式下的受試物處理組和17MT3μg/L對(duì)照進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunnett’spost-hoc檢驗(yàn)?圖G.1比較兩組及以上的試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析流程外果試期記了內(nèi)息可使嵌套ANOA（稱混合ANOA）分這數(shù)中隨效項(xiàng)考到行孔帶的變性后行后驗(yàn)如Dunnett’s檢驗(yàn)，以確定差異的大小和顯著性?如果僅比較兩組數(shù)據(jù)，例如3μg/L17MT激動(dòng)劑對(duì)照組和3μg/L17MT+500μg/L氟酰胺拮抗劑對(duì)照組，則應(yīng)首先通過(guò)D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)，以確定每個(gè)暴露組的數(shù)是為態(tài)布果個(gè)露的據(jù)為態(tài)布應(yīng)行Welh正的stuent-t檢驗(yàn)?如果一個(gè)或兩個(gè)暴露組的數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，應(yīng)進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)?GB/TGB/TXXXXX—XXXXH（資料性附錄）SPG1-GFP品系日本青鳉的獲取于spg-gfp鳉基品的取以過(guò)WathFrg及關(guān)驗(yàn)獲該系些實(shí)驗(yàn)室包括TEFOR,France;TheNationalBioResourceProject,Japan;IDEAConsulting,Japan;TheNationalMuseumofNaturalHistory,France，ibaconGmbH?Eurofins?CharlesRiver和Scymaris使用該品系魚類需要同相關(guān)實(shí)驗(yàn)室簽署協(xié)議?25PAGEPAGE26參 考 文 獻(xiàn)[1]Borg,B.,Antonopoulou,E.,Andersson,E.,Carlberg,T.,Mayer,I.1993.Effectivenessofseveralandrogensinstimulatingkidneyhypertrophy,asecondarysexualcharacter,incastratedmalethreespinedsticklebacks,Gasterosteusaculeatus.Can.J.Zool.7,2327–2329.[2]Cui,J.,Shen,X.,Yan,Z.,Zhao,H.,andNagahama,Y.(2009).Homology-modeledligand-bindingdomainsofmedakaestrogenreceptorsandandrogenreceptors:amodelsystemforthestudyofreproduction.Biochem.Biophys.Res.Commun.380,115–121.[3]Hahlbeck,E.,Katsiadaki,I.,Mayer,I.,Adolfsson-Erici,M.,James,J.,andBengtsson,B.-E.(2004).Thejuvenilethree-spinedstickleback(GasterosteusaculeatusL.)asamodelorganismforendocrinedisruptionII--kidneyhypertrophy,vitellogeninandspiggininduction.Aquat.Toxicol.70,311–326.[4]Horie,Y.,Watanabe,H.,Takanobu,H.,Yagi,A.,Yamagishi,T.,Iguchi,T.,andTatarazako,N.(2017).Developmentofaninvivoanti-androgenicactivitydetectionassayusingfenitrothioninJapanesemedaka(Oryziaslatipes).J.Appl.Toxicol.37,339–346.[5]HornungM.W.,CookP.M.,FitzsimmonsP.N.,KuehlD.W.,NicholsJ.W.(2007).Tissuedistributionandmetabolismofbenzo[a]pyreneinembryonicandlarvalmedaka(Oryziaslatipes).Toxicol.Sci.100,393–405.[6]Hutchinson,T.H.,Shillabeer,N.,Winter,M.J.,andPickford,D.B.(2006).Acuteandchroniceffectsofcarriersolventsinaquaticorganisms:Acriticalreview.Aquat.Toxicol.76,69–92.[7]Iwamatsu,T.(2004).StagesofnormaldevelopmentinthemedakaOryziaslatipes.Mech.Dev.121,605–618.Iwamatsu,T.,Kobayashi,H.,andYamashita,M.(2006).Sexreversalinmedakatreatedinvitrowith17α-methyldihydrotestosteroneduringoocytematuration.Dev.GrowthDiffer.48,59–64.[8]Jakobsson,S.,Borg,B.,Haux,C.,andHyllner,S.J.(1999).An11-ketotestosteroneinducedkidneysecretedprotein:thenestbuildinggluefrommalethree-spinedstickleback,Gasterosteusaculeatus.FishPhysiol.Biochem.20,79–85.[9]Jolly,C.,Katsiadaki,I.,Morris,S.,LeBelle,N.,Dufour,S.,Mayer,I.,Pottinger,T.G.,andScott,A.P.(2009).Detectionoftheanti-androgeniceffectofendocrinedisruptingenvironmentalcontaminantsusinginvivoandinvitroassaysinthethree-spinedstickleback.Aquat.Toxicol.92,228–239.[10]KashiwadaS.,GokaK.,ShiraishiH.,ArizonoK.,OzatoK.,WakamatsuY.,HintonD.E.(2007).AgedependentinsituhepaticandgillCYP1Aactivityinthesee-throughmedaka(Oryziaslatipes).Comp.Biochem.Physiol.CToxicol.Pharmacol.145,96–102.[11]Katsiadaki,I.,Morris,S.,Squires,C.,Hurst,M.R.,James,J.D.,andScott,A.P.(2006).Useofthethreespinedstickleback(Gasterosteusaculeatus)asasensitiveinvivotestfordetectionofenvironmentalantiandrogens.Environ.HealthPerspect.114Suppl1,115–121.[12]Katsiadaki,I.,Scott,A.P.,Mayer,I.2002a.PotentialofthesticklebackasacombinedbiomarkerforestrogensandandrogensinEuropeanwaters.Mar.Environ.Res.54,725–728.[13]Katsiadaki,I.,Scott,A.P.,Hurst,M.R.,Matthiessen,P.,Mayer,I.200b.Detectionofenvironmentalandrogens:anovelmethodbasedonenzyme-linkedimmunosorbentassayofspiggin,thestickleback(Gasterosteusaculeatus)glueprotein.Environ.Toxicol.Chem.21,1946–1954.[14]Kawahara,R.,andNishida,M.(2007).Extensivelineage-specificgeneduplicationandevolutionofthespigginmulti-genefamilyinstickleback.BMCEvol.Biol.7,209.[15]Kinoshita,M.,Murata,K.,Naruse,K.,andTanaka,M.(2009).Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols(JohnWiley&Sons).[16]Kiparissis,Y.,Metcalfe,T.L.,Balch,G.C.,andMetcalfe,C.D.(2003).Effectsoftheantiandrogens,vinclozolinandcyproteroneacetateongonadaldevelopmentintheJapanesemedaka(Oryziaslatipes).Aquat.Toxicol.63,391–403.[17]Kullman,S.W.,andHinton,D.E.(2001).Identification,characterization,andontogenyofasecondcytochromeP4503Agenefromthefreshwaterteleostmedaka(Oryziaslatipes).Mol.Reprod.Dev.58,149–158.[18]Masuyama,H.,Yamada,M.,Kamei,Y.,Fujiwara-Ishikawa,T.,Todo,T.,Nagahama,Y.,andMatsuda,M.(2012).Dmrt1mutationcausesamale-to-femalesexreversalafterthesexdeterminationbyDmyinthemedaka.ChromosomeRes.20,163–176.[19]Matsuda,M.,Nagahama,Y.,Shinomiya,A.,Sato,T.,Matsuda,C.,Kobayashi,T.,Morrey,C.E.,Shibata,N.,Asakawa,S.,Shimizu,N.,etal.(2002).DMYisaY-specificDM-domaingenerequiredformaledevelopmentinthemedakafish.Nature417,559–563.[20]Murata,K.,Kinoshita,M.,Naruse,K.,Tanaka,M.,andKamei,Y.(2019).Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols(JohnWiley&Sons).Muschket,M.,DiPaolo,C.,Tindall,A.J.,Touak,G.,Phan,A.,Krauss,M.,Kirchner,K.,Seiler,T.-B.,Hollert,H.,andBrack,W.(2018).Identificationofunknownantiandrogeniccompoundsinsurfacewatersbyeffect-directedanalysis(EDA)usingaparallelfractionationapproach.Environ.Sci.Technol.52,288–297.[21]Nakamura,A.,Takanobu,H.,Tamura,I.,Yamamuro,M.,Iguchi,T.,andTatarazako,N.(2014).VerificationofresponsesofJapanesemedaka(Oryziaslatipes)toanti-androgens,vinclozolinandflutamide,inshort-termassays.J.Appl.Toxicol.JAT34,545–553.[22]OECD(1992),TestNo.301:ReadyBiodegradability,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section3,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070349-en.[23]OECD(1998),TestNo.212:Fish,Short-termToxicityTestonEmbryoandSac-FryStages,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070141-en.[24]OECD(2006).CurrentApproachesintheStatisticalAnalysisofEcotoxicityData:AGuidancetoAppl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