《豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（MHC-肽四聚體）（征求意見(jiàn)稿）》編制說(shuō)明

1江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)《豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（MHC-肽四聚體）》編制說(shuō)明傳染病。有研究表明，PRRSV感染后能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體巴細(xì)胞（CTLs）是機(jī)體有效控制各種病毒感染的重要免疫細(xì)胞織相容性復(fù)合體（Majorhistocompatilitycomplex,MHC）I類(lèi)分子限特異性CTL反應(yīng)是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，控制PRRSV感染的早期診斷也具有重要的意義。當(dāng)前尚缺乏客細(xì)胞的一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)。四個(gè)MHC-肽復(fù)合物（pMHC）通過(guò)生物素蛋白連接酶（Biotin-proteinligasTCR）的結(jié)合力，借助流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，具有高靈敏性和高特異性（圖1）。本文件中以豬群優(yōu)勢(shì)等位基因型和病毒保守抗原表位肽建立檢測(cè)PRRSV特異性馴化效果評(píng)估和病毒感染的早期診斷。2024年8月，江蘇立華牧業(yè)股份有限公司與呼吸綜合征病毒細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（MHC-肽四聚體2圖1：MHC肽四聚體組份示意圖引自/將《豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（MHC-肽2024年度省地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)劃，由江蘇立華牧業(yè)股份有限公司制定江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)《豬繁殖與呼吸綜合征標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)調(diào)研、全部試驗(yàn)研究和驗(yàn)證工作通常對(duì)同源PRRSV株具有特異性，3IFN-γ+細(xì)胞相關(guān)。PRRSV特異性T細(xì)胞在感染TCR、一分子的MHCI分子及對(duì)應(yīng)的特異性抗），4PEmouseanti-pigCD4+,0.2mg/），限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和XhoI克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pColdI中，構(gòu)建重組質(zhì)粒限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和XhoI消化鑒定，可見(jiàn)1300bp左右大小的片段，成功獲將上述鑒定陽(yáng)性重組菌分別接種5mL含有氨芐青霉素（Amp+）的培養(yǎng)基，菌BL21(DE3)/pColdI-GP5-β2m-α和BL21(DE3)/pColdI570kD55kD40kD圖2：SDS分析SLA重組菌表達(dá)M：預(yù)染中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)0：BL21(DE3)/pColdI空載體誘導(dǎo)后全菌裂解物1：BL21(DE3)/pColdI-GP5-β2m-α誘導(dǎo)后全菌裂解物2：BL21(DE3)/pColdI-N-β2m-α誘導(dǎo)后全菌裂解物5-cagtggtggtggtggtggtgCTCGAGtttct），++600=0.533kD有明顯蛋白條帶（圖3）。M0170kD55kD40kD35kD25kD圖3：SDS分析BirA重組菌表達(dá)M：預(yù)染中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)0：BL21(DE3)/pET28a空載體誘導(dǎo)后全菌裂解物1：BL21(DE3)/pET28a-BirA誘導(dǎo)后全菌裂解物同時(shí)將質(zhì)粒pET28a-BirA分別與pC表達(dá)2個(gè)重組質(zhì)粒的菌株BL21(DE3)/pET28a-BirA6重組菌BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-GP5-β2m-α和BL21(DE3)/pET28a-BirA/然后再經(jīng)Westernblot鑒定目的70kD55kD40kD35kD25kD圖4：SDS分析共轉(zhuǎn)化重組菌表達(dá)M：預(yù)染中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)0：BL21(DE3)/pET28a/pColdI空載體誘導(dǎo)后全菌裂解物1-3：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-GP5-β2m-α誘導(dǎo)后全菌裂解物4-6：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-N-β2m-α誘導(dǎo)后全菌裂解物70kD55kD40kD35kD25kD圖5：Westernblot檢測(cè)共轉(zhuǎn)化重組菌體內(nèi)靶蛋白生物化效果M：預(yù)染中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)0：BL21(DE3)/pET28a/pColdI空載體誘導(dǎo)后全菌裂解物1-3：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-GP5-β2m-α誘導(dǎo)后全菌裂解物4-6：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-N-β2m-α誘導(dǎo)后全菌裂解物7蛋白純化儀，去離子水洗AB管道，洗掉系統(tǒng)里20%無(wú)水和bindingbuffer洗滌新柱子，直到UV280nm線水平即可。然后上蛋白樣品，密buffer除去雜蛋白，UV280nm線水平即可。之后，elutionbuf有峰則收集，并將收集的樣品置于冰上，UV280nm線出提高蛋白純度，將elution洗脫蛋白透析除咪唑后再100kD70kD55kD40kD圖6：SDS分析生物素化重組蛋白純化效果M：預(yù)染中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)1-2：BGP5-SLA重組蛋白；3-4：BN-SLA重組蛋白），tetramer和PE-BN-SLA-te8mouseanti-pigCD8a和PE-pSLA-tetramer（PE-BGP5-SLA-tetramer或適量（一般不超過(guò)300uL）FACS緩沖液中，盡快上機(jī)分析。單染管對(duì)照（FITCmouseanti-pigCD3+只是版本號(hào)不同，優(yōu)先使用高版本號(hào)軟件。首先FSC/SS然后再根據(jù)APC-CD8+/FITC-CD3+雙參數(shù)獲得CD3+即抗原特異CTL細(xì)胞的百分比。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，以pSLA+-tetram選擇PRRSV抗體和抗原陰性1月齡的大白豬36頭，其中7PE-BN-SLA-tetramer）、1%（v/v）的APC-anti-pigCD液中，上機(jī)分析APC-anti-pigCD8a和PE-BGP5-SLA-tetra分比是對(duì)照組（未免疫組）的3.45倍（圖7B），表明VR2332弱毒疫苗激發(fā)了靶向PRRSV-N表位的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。圖8可以看到，弱毒疫苗免疫組的），BAB圖7：CD3/CD8/BN-SLA-tetramer檢測(cè)弱毒疫苗（VR2332）特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)A：CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比B：BN-SLA+CD8+占CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞的百分比AB圖8：CD3/CD8/BGP5-SLA-tetramer檢測(cè)弱毒疫苗（VR2332）特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)A：CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比B：BGP5-SLA+CD8+占CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞的百分比例出現(xiàn)顯著下降（圖9A）；CD8+T細(xì)胞比例分別于加強(qiáng)免疫和攻毒后均顯著升高（圖9B）；從而導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值隨著免疫和攻毒出現(xiàn)性靶向PRRSVN肽表位的CD8+細(xì)胞比例，即BN-SLA+CD8+比例升高有限。 ABC圖9：CD3/CD4/CD8檢測(cè)滅活疫苗（NADC30-like）特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)A：CD4+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比B：CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比C：CD4+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞與CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞百分比的比值A(chǔ)B圖10：CD3/CD8/BN-SLA+檢測(cè)滅活疫苗（NADC30-like）特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)A：CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比B：BN-SLA+CD8+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD8+CD3+T細(xì)胞的百分比AB圖11：CD3/CD8/BGP5-SLA+檢測(cè)滅活疫苗（NADC30）特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)A：CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比B：BGP5-SLA+CD8+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD8+CD3+T細(xì)胞的百分比作為陰性對(duì)照，其余全部感染PRRSV（NA），（圖12B），表明NADC30-like感染激發(fā)了靶向PRRSVN表位的特異性細(xì)胞免+CD3+），靶向PRRSVGP5表位的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，且與感染劑量呈正相關(guān)。AB圖12：CD3/CD8/BN-SLA+檢測(cè)感染NADC30-like感染后特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)A：CD8+CD3+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比B：BN-SLA+CD8+雙陽(yáng)T細(xì)胞占CD8