毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則

毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則

（征求意見(jiàn)稿）

中國(guó)食品藥品檢定研究院

2023年9月

目錄

一、概述.................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

二、基本原則.............................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

三、基本內(nèi)容.............................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

（一）毒代動(dòng)力學(xué)研究必要性評(píng)估.........錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

（二）暴露量評(píng)估.......................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

（三）毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)...................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

（四）暴露方案.........................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

（五）樣品采集.........................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

（六）分析方法.........................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

（七）方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證...................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)價(jià)........................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

五、報(bào)告.................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

六、參考文獻(xiàn).............................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

七、名詞解釋.............................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。

一、概述

毒代動(dòng)力學(xué)是研究受試物在機(jī)體內(nèi)量變規(guī)律的科學(xué)。其研究目的

是獲知受試物在毒性試驗(yàn)中不同劑量水平下的全身暴露程度和持續(xù)

時(shí)間，預(yù)測(cè)受試物在人體暴露時(shí)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

當(dāng)化妝品原料經(jīng)皮膚吸收后在體內(nèi)有一定暴露時(shí)，或其在體內(nèi)代

謝轉(zhuǎn)化可能會(huì)對(duì)其潛在毒性、體內(nèi)分布和排泄造成重要影響時(shí)，需要

進(jìn)行化妝品原料的毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，定量地研究原料在體內(nèi)的吸收、

分布、代謝、排泄的過(guò)程和特點(diǎn)，探討其毒性發(fā)生和發(fā)展的規(guī)律、體

內(nèi)的分布和靶器官c毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)研究結(jié)果可用于闡述毒性試驗(yàn)中

化妝品原料的全身暴露及其與劑量和時(shí)間的關(guān)系，結(jié)合功效及毒性來(lái)

指導(dǎo)人體試驗(yàn)設(shè)計(jì)向安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，同時(shí)為動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果外推到人時(shí)

的不確定因子提供理論支持，以及在特定情況下通過(guò)對(duì)其體內(nèi)/體外

生物轉(zhuǎn)化研究，以證明或排除某些不良反應(yīng)。本指導(dǎo)原則適用于化妝

品原料的毒代動(dòng)力學(xué)研究。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)以及當(dāng)前科學(xué)認(rèn)知水平下制定

的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的更新完善，以及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將適時(shí)進(jìn)行

調(diào)整。

二、基本原則

試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)的原則。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)結(jié)合化妝品原料的特性、功效和使用人群等情況進(jìn)

行綜合評(píng)估，體現(xiàn)整體性、綜合性的原則。

應(yīng)在遵循化妝品安全性評(píng)價(jià)一般原見(jiàn)的基礎(chǔ)上，具體問(wèn)題具體

分析，結(jié)合原料特點(diǎn)，在闡明其試驗(yàn)方法或檢測(cè)技術(shù)科學(xué)、合理的

前提下進(jìn)行規(guī)范性試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面分析評(píng)價(jià)。

毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)通常伴隨毒性試驗(yàn)進(jìn)行，即開(kāi)展伴隨毒代動(dòng)力學(xué)

試驗(yàn)。開(kāi)展研究時(shí)還需考慮動(dòng)物樣本的差異性，可在所有動(dòng)物或有代

表性的劑量組或衛(wèi)星組動(dòng)物中進(jìn)行，以獲得相應(yīng)的毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。

三、基本內(nèi)容

（一）毒代動(dòng)力學(xué)研究必要性評(píng)估

人體暴露于化妝品主要是通過(guò)皮膚?；瘖y品成分必須穿過(guò)皮膚的

許多細(xì)胞層，才能到達(dá)循環(huán)（血液和淋巴管）系統(tǒng)，其中決定速率的

層是角質(zhì)層。

對(duì)于無(wú)透皮吸收的化妝品原料，無(wú)需進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究，但需

提供無(wú)透皮吸收的客觀證明資料；對(duì)于透皮吸收且在人體體內(nèi)有較高

暴露的化妝品原料，需進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究。

（二）暴露量評(píng)估

毒代動(dòng)力學(xué)所用動(dòng)物數(shù)量應(yīng)保證能獲得足夠的毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，

根據(jù)化妝品的特性選擇嚙齒類(lèi)動(dòng)物和/或非嚙齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。通

常采用兩種性別動(dòng)物，雌雄各半。

暴露評(píng)估應(yīng)考慮的主要因素有血漿蛋白結(jié)合、組織攝取、受體性

質(zhì)和代謝特征的種屬差異、代謝物的活性、免疫原性和毒理學(xué)作用。

化妝品原料透過(guò)皮膚在血漿中濃度較低時(shí)，應(yīng)關(guān)注特殊的組織或器

官，可能會(huì)有較高水平的受試物和/或其代謝物。

（三）毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

毒代動(dòng)力學(xué)研究通過(guò)測(cè)定合適時(shí)間點(diǎn)的樣品濃度來(lái)計(jì)算動(dòng)力學(xué)

參數(shù)。暴露程度可用原型化合物和/或其代謝物的血漿（血清或全血）

濃度或AUC來(lái)表示。某些情況下，可選擇測(cè)定組織中的受試物濃度。

用于評(píng)估的毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)主要有AUCo_t、Cmax、Tmax、1/2、蓄

積常數(shù)。

（四）暴露方案

毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)的暴露方案設(shè)計(jì)應(yīng)遵循毒性試驗(yàn)研究方案設(shè)計(jì)

原則，包括暴露劑量、途徑、動(dòng)物種屬選擇和暴露頻率、周期等。

毒性研究的劑量設(shè)置主要依據(jù)受試動(dòng)物的毒性反應(yīng)確定，通常設(shè)

置低、中、高3個(gè)劑量組和溶劑對(duì)照組，必要時(shí)還需設(shè)立空白對(duì)照組

和/或陽(yáng)性對(duì)照組。低劑量一般是無(wú)毒性反應(yīng)劑量，最好等同或略高

于原料人體實(shí)際局部或全身暴露量。高劑量原則上應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生明顯

毒性反應(yīng)的前提下又不引起動(dòng)物死亡率過(guò)高，以保證試驗(yàn)結(jié)果得到有

意義的評(píng)價(jià)結(jié)論。在高、低劑量之間應(yīng)再設(shè)至少一個(gè)中劑量組，組間

距一般按等比例計(jì)算。中劑量組一般應(yīng)引起較輕的可觀察到的毒性作

用，若設(shè)置多個(gè)中劑量組，則各組的染毒劑量應(yīng)引起不同程度毒性作

用。對(duì)于毒性較低的化妝品原料，如染毒濃度超過(guò)1000mg/kg時(shí)仍

未產(chǎn)生可觀察到的毒性效應(yīng)，并且可根據(jù)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物預(yù)期其毒

性時(shí)，可盡量采用一個(gè)最大染毒濃度或暴露量，并可以考慮不必進(jìn)行

三個(gè)劑量水平的全面試驗(yàn)觀察。當(dāng)毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明化合物的吸收

特性限制了母體化合物和/或代謝物暴露，且無(wú)其它劑量限制因素存

在時(shí)，該化合物能達(dá)到最大暴露的最低劑量將被認(rèn)為是可采用的最高

劑量。此外，高劑量設(shè)計(jì)需考慮劑量限制性的受試物效應(yīng)、吸收飽和、

最大的可行性暴露劑量。當(dāng)吸收過(guò)程限制了化合物或其代謝物的暴露

水平，達(dá)到最大暴露的最小劑量可認(rèn)為是高劑量。當(dāng)增加劑量導(dǎo)致非

線性動(dòng)力學(xué)時(shí)，應(yīng)特別注意其與毒性研究中毒性反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，手線

性動(dòng)力學(xué)并不意味著劑量不可以遞增，也不意味著不會(huì)有新毒性反應(yīng)

出現(xiàn)。

（五）樣品采集

伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究中，樣品采集的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)盡量達(dá)到所需的頻

度，但不可過(guò)于頻繁，以至于干擾正常進(jìn)行的研究并引起動(dòng)物過(guò)度的

生理應(yīng)激反應(yīng)。每項(xiàng)研究中的時(shí)間點(diǎn)數(shù)量應(yīng)滿足暴露評(píng)價(jià)的要求，時(shí)

間點(diǎn)的確定應(yīng)以早期毒性試驗(yàn)、預(yù)試驗(yàn)或劑量探索試驗(yàn)以及在相同動(dòng)

物模型或可以合理外推的其它動(dòng)物模型上獲得的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。

應(yīng)該考慮樣品是從所有的試驗(yàn)動(dòng)物采集，還是從具有一定代表性

的劑量組或衛(wèi)星組動(dòng)物來(lái)采集。通常情況下，在大動(dòng)物的毒性試驗(yàn)中

毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)從主研究試驗(yàn)動(dòng)物采集；而嚙齒動(dòng)物的毒性試驗(yàn)中毒

代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可從衛(wèi)星組試驗(yàn)動(dòng)物收集。

采集血樣的前提是受試物在血漿中的暴露量與作用靶點(diǎn)或毒性

靶點(diǎn)的受試物濃度存在動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，并且受試物容易進(jìn)入動(dòng)物和人

的全身系統(tǒng)；否則，可能需要考慮采用尿液、其它體液、靶組織或器

官來(lái)測(cè)定受試物濃度。

（六）分析方法

毒代動(dòng)力學(xué)的分析方法應(yīng)基于早期建立的分析物和生物基質(zhì)的

分析方法，且要根據(jù)代謝和種屬差異而定。毒代動(dòng)力學(xué)研究使用的分

析方法對(duì)于受試物來(lái)說(shuō)應(yīng)該是特異性的，而且應(yīng)有足夠的精確度和精

密度，檢測(cè)限應(yīng)滿足毒代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)預(yù)測(cè)的濃度范圍。分析物和生

物基質(zhì)分析方法的選擇應(yīng)排除樣本中內(nèi)源性物質(zhì)可能引起的干擾。通

常選擇血漿、血清或全血作為毒代動(dòng)力學(xué)研究的基質(zhì)。目前常用的分

析方法主要有液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS/MS）和放射性同位素標(biāo)

記技術(shù)（Radiolabelingtechnique）等。

（七）方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證

在分析方法開(kāi)發(fā)前，應(yīng)充分了解受試物（例如確定受試物的物理

化學(xué)性質(zhì)、體外和體內(nèi)代謝以及蛋白結(jié)合），并考慮可能適用的先前

分析方法的各個(gè)方面。

方法開(kāi)發(fā)涉及優(yōu)化受試物提取和檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程和條件，需要優(yōu)

化的參數(shù)應(yīng)包括標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品、關(guān)鍵試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品、

選擇性和特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、受試物基質(zhì)穩(wěn)

定性、最低稀釋度，以確保該方法適合于驗(yàn)證。

為了對(duì)受試物進(jìn)行定量，建立分析方法時(shí)，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行完整驗(yàn)證。

色譜法驗(yàn)證內(nèi)容應(yīng)包括選擇性、特異性、基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和范圍、

準(zhǔn)確度和精密度、殘留、稀釋完整性、穩(wěn)定性和重進(jìn)樣重現(xiàn)性。

四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)價(jià)

暴露評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)應(yīng)有代表性。由于動(dòng)力學(xué)參數(shù)多存在個(gè)體差異，

且毒代動(dòng)力學(xué)資料多來(lái)源于小樣本的動(dòng)物，因此，應(yīng)注意求算平均值

或中位數(shù)并評(píng)估變異情況。某些情況下，個(gè)體動(dòng)物的數(shù)據(jù)或許比經(jīng)整

理、統(tǒng)計(jì)分析過(guò)的成組資料更為重要。

在評(píng)估毒代動(dòng)力學(xué)連續(xù)給藥引起的受試物體內(nèi)蓄積問(wèn)題時(shí)，不僅

要觀察是否出現(xiàn)蓄積現(xiàn)象，還要結(jié)合受試物半衰期長(zhǎng)短、受試物暴露

對(duì)關(guān)鍵代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響等方面進(jìn)行分析，并注意種屬差異。

五、報(bào)告

完整的毒代動(dòng)力學(xué)資料應(yīng)包括對(duì)毒代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果的自身評(píng)

價(jià)和對(duì)毒性反應(yīng)的相關(guān)解釋?zhuān)?bào)告分析方法，說(shuō)明測(cè)試中所選基質(zhì)

和分析物的理由。毒代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果分析應(yīng)比較分析受試物和/或其

代謝物的功效、毒性、代謝，采用暴露量來(lái)評(píng)價(jià)化妝品的安全范圍。

六、參考文獻(xiàn)

1.ICHGuidelineS3B,Pharmacokinetics:repeateddosetissue

distributionstudies,1995.

2.ICHGuidelineS3A,Toxicokinetics:Aguidanceforassessing

systemicexposureintoxicologystudies,1995.

3.OECDGuidance417:Toxicokinetics,2010.

4.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局，化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版），

2015.12

5.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局，化妝品安仝評(píng)估技術(shù)導(dǎo)則（2021

年版），2021.4

6.ICHHarmonisedGuidelineBioanalyticalMethodValidationM10,

2019.

7.SCCS化妝品成分測(cè)試及其安全性評(píng)估指南（第12版），2023.5

七、名詞解釋

毒-時(shí)曲線下面積（AUCo-t）（areaundertheplasma

concentration-timecurve）：血漿受試物濃度-時(shí)間曲線下的面積，代

表機(jī)體在一段時(shí)間內(nèi)吸收的受試物的量。在線性條件下，受試物的

AUC（從時(shí)間零到無(wú)窮）與吸收量成比例，而與吸收速率無(wú)關(guān)。

峰濃度（Cmax）：指染毒后血漿或血清中受試物的最高濃度，或

在尿或糞便中的最大排泄量。

達(dá)峰時(shí)間（Tmax）：血中受試物濃度達(dá)到峰值（Cmx）的時(shí)間。

生物半衰期（ti/2）（Biologicalhalflife）：受試物在體內(nèi)的量

或濃度減少一半所需的時(shí)間，單位為h或min。

毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)方法

毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

Toxicokinetics

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了化妝品原料毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于經(jīng)皮膚吸收后可能產(chǎn)生全身暴露風(fēng)險(xiǎn)的化妝品原料的毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的

測(cè)定。

2方法提要

化妝品原料經(jīng)皮膚暴露吸收入血，通過(guò)檢測(cè)?系列時(shí)間點(diǎn)的血漿濃度,來(lái)定量受試物（原

型和/或其主要代謝產(chǎn)物）的暴露量，是對(duì)毒性反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，是解釋種屬、劑量、

性別間的毒性差異與受試物暴露量的關(guān)系。通常毒代動(dòng)刀學(xué)是伴隨毒性研究進(jìn)行的，有時(shí)也

會(huì)單獨(dú)設(shè)計(jì)。通常用血漿（全血或血清）的毒-時(shí)曲線下面積（AUCoQ和達(dá)峰濃度（C?m）

評(píng)價(jià)受試物的暴露程度。

目前進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的定量方法是液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）和放射性同

位素標(biāo)記技術(shù)（Radiolabelingtechnique）,用來(lái)開(kāi)展毒代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的方法需要滿足特異性

并具有足夠的精密度和準(zhǔn)確度。非臨床研究檢測(cè)的受試物和基質(zhì)最好與臨床研究時(shí)相同，并

且需要按照有關(guān)生物分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

3試劑和材料

3.1受試物

受試物的純度及其雜質(zhì)的含量應(yīng)符合以下要求：一段受試物純度不應(yīng)低于98%,雜質(zhì)

應(yīng)低于2%；采用放射性同位素標(biāo)記的受試物，其放化純度不應(yīng)低于95%。

標(biāo)記的受試物常用于物料平衡和代謝產(chǎn)物鑒定研究。如有可能，應(yīng)將放射性同位素

標(biāo)記在受試物分子的核心骨架上，這樣的標(biāo)記化合物具有代謝穩(wěn)定性。將化合物分子的多個(gè)

部位或特定區(qū)域進(jìn)行放射性標(biāo)記有利于探討該受試物的生物轉(zhuǎn)化。

3.2對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的性質(zhì)至關(guān)重要，其質(zhì)量會(huì)影響分析結(jié)果，從而影響研究數(shù)據(jù)，因此要確保

其質(zhì)量（純度、規(guī)格、鑒別）和內(nèi)標(biāo)的適用性。方法驗(yàn)證和試驗(yàn)樣品分析過(guò)程中使用的對(duì)照

標(biāo)準(zhǔn)品的來(lái)源應(yīng)可靠并可追溯，并且其化學(xué)形式應(yīng)與受試物相同。如果無(wú)法獲得與受試物相

同的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用質(zhì)量可控的其他化學(xué)形式的物質(zhì)（例如鹽或水含物）。

適合的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品包括藥典標(biāo)準(zhǔn)品、商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品或經(jīng)充分驗(yàn)證的內(nèi)部或外部非商業(yè)組

織制備的標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)提供分析證書(shū)（CoA）或同等的其他材料來(lái)證明對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，應(yīng)

包括有關(guān)純度、儲(chǔ)存條件、重新標(biāo)定/失效口期和批號(hào)的相關(guān)信息。

內(nèi)標(biāo)不需要提供分析證書(shū)，只要證明其適用性即可，例如能夠證明該物質(zhì)本身或其相關(guān)

的任何雜質(zhì)對(duì)于受試物的檢測(cè)不會(huì)產(chǎn)生干擾。

使用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，建議使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的受試物作為內(nèi)標(biāo)。同位素內(nèi)標(biāo)必須具

有足夠高的同位素純度，并且不發(fā)生同位素交換反應(yīng)。應(yīng)檢測(cè)是否存在未標(biāo)記受試物，如果

存在，則必須在方法驗(yàn)證期間評(píng)估具潛在影響。

儲(chǔ)備液和工作液應(yīng)當(dāng)使用分析證書(shū)所標(biāo)明的穩(wěn)定期內(nèi)（即有效期或早期開(kāi)發(fā)前的重新標(biāo)

定FI期）的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品制備。

3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

要求至少可以產(chǎn)生足夠的毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，通常采月兩種性別。數(shù)量和毒性研究與主試

驗(yàn)數(shù)量相當(dāng)（每性別每種屬至少有4只動(dòng)物）。

相關(guān)動(dòng)物種屬的選擇應(yīng)充分考慮受試物的代謝特征與人體的相似性，以及動(dòng)物對(duì)受試物

的敏感性。一般要求采用1個(gè)動(dòng)物種屬進(jìn)行。當(dāng)不存在基于受試物機(jī)制或代謝的物種差別時(shí)，

通常采用大鼠進(jìn)行化妝品原料的毒代動(dòng)力學(xué)研究。

4儀器和設(shè)備

4.1液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀

4.2放射性檢測(cè)器

4.3液閃儀

4.4電子天平

4.5高速冷凍離心機(jī)

4.6渦旋混勻器

4.7超聲儀

4.8移液器

5試蛉步獴

5.1預(yù)試驗(yàn)

在正式試驗(yàn)開(kāi)始以前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，其目的主要是確定正式試驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容（劑量范圍、

采集時(shí)間），以及為正式的試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

設(shè)計(jì)合適的劑量水平，以達(dá)到足夠的暴露量，并參照毒理學(xué)對(duì)劑量設(shè)計(jì)的要求。低劑量

通常設(shè)計(jì)為無(wú)毒性反應(yīng)劑量，其暴露水平最好高于人體的暴露水平。中劑量通常根據(jù)毒性研

究的目的設(shè)“成暴露是低劑量的一定倍數(shù)。高劑量通常取決丁毒理學(xué)特點(diǎn)，根據(jù)暴露途徑不

同，應(yīng)設(shè)計(jì)成產(chǎn)生最大暴露品的最低給予劑最。

設(shè)計(jì)合適的采樣時(shí)間點(diǎn)，采樣時(shí)間點(diǎn)應(yīng)盡量達(dá)到所需的頻度，但不可過(guò)于頻繁，以至于

干擾正在進(jìn)行的研究并引起動(dòng)物過(guò)度的生理應(yīng)激反應(yīng)。采樣時(shí)間點(diǎn)的設(shè)計(jì)應(yīng)兼顧受試物的吸

收相、平衡相（峰濃度附近）和消除相。整個(gè)采樣時(shí)間應(yīng)持續(xù)到3?5個(gè)半衰期，或持續(xù)到

受試物濃度為Cm的1/10~1/20。

5.2生物分析方法開(kāi)發(fā)（色譜法）

生物分析方法開(kāi)發(fā)的目的是確定方法的設(shè)計(jì)、操作條件、局限性和適用性以達(dá)到預(yù)期目

的，并確保分析方法已被優(yōu)化，可用于驗(yàn)證。

在生物分析方法開(kāi)發(fā)之前，應(yīng)充分了解受試物（如確定新原料的物理化學(xué)性質(zhì)、體外和

體內(nèi)代謝以及蛋白結(jié)合）。

方法開(kāi)發(fā)涉及優(yōu)化受試物提取和檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程和條件，包括優(yōu)化以下參數(shù)以確保該方

法適用于驗(yàn)證：標(biāo)準(zhǔn)品/近照品、關(guān)鍵試劑、校準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品、選擇性和特異性、靈敏

度、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、受試物基質(zhì)穩(wěn)定性、最低稀釋度。

方法開(kāi)發(fā)一旦完成，需經(jīng)過(guò)方法驗(yàn)證證明該優(yōu)化的方法適用于試驗(yàn)樣品分析

5.3生物分析方法驗(yàn)證（色譜法）

5.3.1選擇性

選擇性是分析方法在空白生物基質(zhì)中存在潛在干擾物質(zhì)（非特異性干擾）的情況下區(qū)分

和測(cè)定受試物的能力.

應(yīng)使用至少6個(gè)個(gè)體來(lái)源/批次（非溶血和非高脂）的空白基質(zhì)（不含受試物或內(nèi)標(biāo)的

基質(zhì)樣品）證明選擇性。在不同來(lái)源的基質(zhì)難以獲得的情況下，可以使用更少來(lái)源的基質(zhì)。

同時(shí)還應(yīng)評(píng)估內(nèi)標(biāo)的選擇性。

選擇性的評(píng)估應(yīng)證明空白樣品中受試物或內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間處沒(méi)有干擾組分引起的顯著

響應(yīng)。干擾組分的響應(yīng)應(yīng)不高于受試物定量卜.限響應(yīng)的20%,并且不高于每個(gè)基質(zhì)定晟下

限樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%?

532特異性

特異性是生物分析方法檢測(cè)和區(qū)分受試物與其他物質(zhì)的能力，包括相關(guān)物質(zhì)（如與受試

物結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)、代謝物、異構(gòu)體、雜質(zhì)、樣品制備過(guò)程中形成的降解產(chǎn)物）。

如果生物基質(zhì)中預(yù)計(jì)存在相關(guān)物質(zhì)，則應(yīng)在方法驗(yàn)證期間或者在試驗(yàn)前評(píng)估其影響。當(dāng)

采用LC-MS/MS方法時(shí)，特異性的考察包括比較受試物與潛在干擾相關(guān)物質(zhì)的分子量以及

將相關(guān)物質(zhì)與受試物色譜分離。

5.3.3基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指由于生物基質(zhì)中的干擾物質(zhì)和經(jīng)常未識(shí)別的成分引起的受試物響應(yīng)的改

變。在方法驗(yàn)證過(guò)程中，需要考察不同來(lái)源/批次間的基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)應(yīng)通過(guò)分析至少3個(gè)重復(fù)的低和高濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行評(píng)估，每個(gè)重復(fù)使用至少

6個(gè)不同來(lái)源/批次的基質(zhì)制備。準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示濃度的土15%以?xún)?nèi)，并且所有單個(gè)來(lái)源;批次

基質(zhì)的精密度（變異系數(shù)百分比，%CV）不應(yīng)大于15%。如果基質(zhì)難以獲得，可以允許使

用更少來(lái)源/批次的基質(zhì)。

5.3.4校準(zhǔn)曲線和范圍

校準(zhǔn)曲線用于描述受試物的標(biāo)示濃度與分析響應(yīng)之間的關(guān)系。通過(guò)在空白基質(zhì)中加入已

知濃度受試物制備校正標(biāo)樣，涵蓋相應(yīng)的濃度范圍并組成校準(zhǔn)曲線。配制校正標(biāo)樣的基質(zhì)應(yīng)

與試驗(yàn)樣品基質(zhì)相同。?；辞€的濃度范圍由定量下限（LLOQ,校正標(biāo)樣的最低濃度）和

定量上限（ULOQ,校正標(biāo)樣的最高濃度）來(lái)決定。在方法驗(yàn)證和每一分析批中，每個(gè)受試

物都應(yīng)隨行一條校準(zhǔn)曲線。

應(yīng)使用空白樣品、零濃度樣品（僅添加內(nèi)標(biāo)的空白樣品）和至少6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)

樣（包括定量卜.限和定量上限）制備校準(zhǔn)曲線。

應(yīng)使用簡(jiǎn)單的回歸模型來(lái)充分描述濃度-響應(yīng)關(guān)系。應(yīng)在方法驗(yàn)證期間確定回歸模型、

數(shù)據(jù)加權(quán)和轉(zhuǎn)換方案.空白樣品和零濃度樣品不應(yīng)該包含在校準(zhǔn)曲線回歸方程當(dāng)中.校正標(biāo)

樣可以重復(fù)分析，在這種情況下，所有可接受的重復(fù)數(shù)據(jù)都應(yīng)納入校準(zhǔn)曲線回歸分析。

報(bào)告中應(yīng)包括校準(zhǔn)曲線參數(shù)（線性擬合時(shí)的斜率與截距）、校正標(biāo)樣的回算濃度和計(jì)算

的平均準(zhǔn)確度。應(yīng)提交在驗(yàn)證過(guò)程中所有可接受的校準(zhǔn)曲線，其中包括不同天內(nèi)考察的至少

3個(gè)獨(dú)立批的校準(zhǔn)曲線。校正標(biāo)樣的回算濃度應(yīng)在定量下限標(biāo)示濃度的±20%以?xún)?nèi)，其他水

平應(yīng)在標(biāo)示值的±15%以?xún)?nèi)。至少有75%的校正標(biāo)樣且至少6個(gè)濃度水平應(yīng)符合上述標(biāo)準(zhǔn)。

在使用重復(fù)測(cè)定的情況下，對(duì)于每個(gè)濃度水平，至少50%的校止標(biāo)桿應(yīng)滿足接受標(biāo)準(zhǔn)

（LLOQ±20%,其他濃度±15%）。如果不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)拒絕該校正標(biāo)樣，并重新擬

合去除該點(diǎn)后的校準(zhǔn)曲線，包括回歸分析。

5.3.5準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過(guò)分析批內(nèi)和批間的質(zhì)控樣品來(lái)確定。應(yīng)使用同一批次的數(shù)據(jù)考察

準(zhǔn)確度和精密度。

在方法驗(yàn)證過(guò)程中，應(yīng)制備在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)至少4個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品：LLOQ、

在LLOQ濃度三倍以?xún)?nèi)（低濃度質(zhì)控）、約為校準(zhǔn)曲線范圍的30~50%（中濃度質(zhì)控）和

至少ULOQ的75%（高濃度質(zhì)控）。

批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過(guò)在每一分析批，對(duì)每個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品進(jìn)行至少5樣品

分析來(lái)評(píng)估。批間準(zhǔn)確度和精密度需要通過(guò)對(duì)每個(gè)濃度水平質(zhì)控在至少兩天內(nèi)考察的至少3

個(gè)分析批結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

除LLOQ外，每個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的總體準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±15%以?xún)?nèi)，LLOQ的

準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%以?xún)?nèi)。除LLOQ外，每個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的精密度（％CV）不

應(yīng)超過(guò)15%,LLOQ的精密度不應(yīng)超過(guò)2（）%。

5.3.6殘留

殘留是指前一個(gè)樣品殘留在分析儀器上的殘留物而引起的測(cè)定濃度的變化。

在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)評(píng)估并盡量減少殘留。在驗(yàn)證期間，通過(guò)在ULOQ樣品之后分

析空白樣品來(lái)考察殘留。在ULOQ之后的空白樣品中的殘留應(yīng)不超過(guò)LLOQ樣品中受試物

響應(yīng)的2。％和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%。如果殘留不可避免，則試驗(yàn)樣品不能隨機(jī)進(jìn)樣，應(yīng)考慮具體

措施，在方法驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)并在試驗(yàn)樣品分析時(shí)應(yīng)用，以確保殘留不影響準(zhǔn)確度和精密度。包

括在分析預(yù)期高濃度樣品之后，下一個(gè)試驗(yàn)樣品之前，進(jìn)樣空白樣品。

5.3.7稀釋完整性

稀釋完整件是在必要時(shí)對(duì)樣品稀釋過(guò)程的評(píng)估.以確保不會(huì)對(duì)受試物濃度的準(zhǔn)確度和精

密度造成影響，應(yīng)使用與質(zhì)控樣品來(lái)源相同的空白基質(zhì)進(jìn)行樣品稀釋。

稀釋質(zhì)控樣品的濃度應(yīng)大于ULOQ,采用空白基質(zhì)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋因子至

少5個(gè)測(cè)定值，以確保檢測(cè)濃度在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)被準(zhǔn)確測(cè)量。試驗(yàn)樣品分析過(guò)程中所用稀

釋因子應(yīng)該介于方法學(xué)驗(yàn)證的稀釋因子范圍內(nèi)。稀釋質(zhì)控的平均準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的二15%

之內(nèi)，精密度（%CV）不應(yīng)超過(guò)15%。

5.3.8穩(wěn)定性

應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確保樣品在制備、處理和分析過(guò)程中采取的每一步操作以及使用

的儲(chǔ)存條件不會(huì)影響受試物的濃度。

用于穩(wěn)定性試驗(yàn)的儲(chǔ)存和分析條件，如樣品儲(chǔ)存時(shí)間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑和容器

材料等，都應(yīng)與實(shí)際試驗(yàn)樣品相同。

采用低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品考察試驗(yàn)基質(zhì)中受試物的穩(wěn)定性。低濃度和高濃度

穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)分別在零時(shí)和考察條件下放置后進(jìn)行評(píng)價(jià)。每個(gè)濃度水平/儲(chǔ)存條件;時(shí)間

點(diǎn)至少制備三個(gè)穩(wěn)定性質(zhì)控樣品。

由新鮮制備的校正標(biāo)樣獲得校準(zhǔn)曲線，根據(jù)校準(zhǔn)曲線分析穩(wěn)定性質(zhì)控樣品，同批次隨行

檢測(cè)新鮮制備的質(zhì)控樣品或穩(wěn)定性已被證明的質(zhì)控樣品。每一濃度的均值應(yīng)在標(biāo)示濃度的

±15%范圍內(nèi)。

通常應(yīng)該進(jìn)行下列穩(wěn)定性考察：儲(chǔ)備液和工作液穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、生物樣品前處理

過(guò)程中的穩(wěn)定性（短期穩(wěn)定性）、處埋后樣品穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和全血穩(wěn)定性。

5.3.9重進(jìn)樣重現(xiàn)性

方法的重現(xiàn)性通過(guò)重顯測(cè)定質(zhì)控樣品來(lái)考察，通常包含在精密度和準(zhǔn)確度考察中。但如

果樣品可以重新進(jìn)樣（如在儀器中斷或其他原因如設(shè)備故障的情況卜），應(yīng)當(dāng)考慮重進(jìn)樣重

現(xiàn)性并將其納入方法驗(yàn)證報(bào)告。

5.4樣品前處理

5.4.1樣品均勻化

液體生物樣品在測(cè)定前用渦旋混勻器混勻，以達(dá)到均勻化的目的。糞便和組織等固體樣

品也需要進(jìn)行勻漿處理。

5.4.2去蛋白處理

常用的生物樣品去蛋白處理方法有卜.列幾種：

（1）加入能與水混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽。常用的能與水混溶的有機(jī)溶劑有甲醛、乙

醇、乙睛和丙酮等,常用的中性鹽有硫酸筱、硫酸鈉和氯化鈉等.加入過(guò)量后,蛋白質(zhì)近淀.

離心即可獲得含有受試物及其代謝物的上層澄清液。

（2）加入酸性沉淀劑。常用的酸性沉淀劑有三氯酯酸、百氯酸、磷酸、水楊酸、苦味

酸和偏磷酸等。其沉淀蛋白的條件是pH值需低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)沉淀后離心可得

含有受試物及其代謝物的上層澄清液。

5.4.3受試物及其代謝物的萃取

（I）液液萃取。它基于被測(cè)組分在不相混溶的兩種溶劑中的分配.在萃取過(guò)程中，水

相的pH是重要的參數(shù)；有時(shí)加入一些強(qiáng)離子的無(wú)機(jī)鹽：如氯化鈉），利用鹽析作用，促進(jìn)

組分進(jìn)入有機(jī)相。通過(guò)選擇不同的有機(jī)溶劑可提高選擇性。液-液萃取可用于水為基質(zhì)的樣

品中非極性或弱極性組分的提取，離子型化合物則采用水溶液加熱蒸發(fā)、減壓蒸發(fā)、冷凍干

燥等方法除去溶劑，殘?jiān)糜谏V方法相適應(yīng)的溶劑溶解后進(jìn)樣。根據(jù)堿性組分在堿性pH

介質(zhì)中萃取，酸性組分在酸性pH介質(zhì)中萃取的原則，一般只進(jìn)行1?2次萃取。

<2）固相萃取。利用液相與固定相之間對(duì)萃取化合物的選擇分配系數(shù)不同，將被分析

的化合物從各種化合物的混合物中分離出來(lái)，又可稱(chēng)為液-固萃取法；固相萃取法通常以柱

分離的方式進(jìn)行操作，這類(lèi)柱分為兩類(lèi)。一類(lèi)常使用親水性填充物，采用一種與水相相混溶

的有機(jī)溶劑即可洗脫化合物；另一類(lèi)柱常用疏水性或離子交換樹(shù)脂作為填充物，可以吸附親

脂性化合物，然后用有機(jī)溶劑將化合物洗脫分離。

5.4.4生物樣品中受試物的濃集

用盡量少的萃取液，便待測(cè)組分萃取到小體積溶劑中，然后直.接吸取適量進(jìn)行分析測(cè)定。

采用揮去溶劑的方法，但避免直接加熱濃縮。對(duì)于熱穩(wěn)定的待測(cè)組分，為加速溶劑的揮發(fā)可

將樣品置于一定溫度的水浴中用氮?dú)獾榷栊詺怏w保護(hù)進(jìn)行吹干;對(duì)于熱不穩(wěn)定或易隨氣流揮

發(fā)的待測(cè)組分，可采用減壓法揮去溶劑或冰水浴用惰性氣體氮?dú)獯蹈伞?/p>

5.5樣品檢測(cè)

毒代樣品檢測(cè)通常是檢測(cè)受試物原型，有時(shí)需要考慮原型的存在方式，比如高蛋白結(jié)合

的化合物，需要測(cè)定游離的受試物濃度。在有些情況下檢測(cè)受試物代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)暴露量:

（1）當(dāng)代謝產(chǎn)物是首要的活性成分時(shí)。

（2）當(dāng)有1個(gè)或更多毒理作用的代謝產(chǎn)物，其對(duì)于組織或器官有明顯的作用時(shí)。

（3）當(dāng)受試物被廣泛地代謝，估計(jì)毒性研究中總的暴露量時(shí)測(cè)定血中或組織中主要代

謝產(chǎn)物濃度是唯一可行的方法。

需方法驗(yàn)訐完成之后再進(jìn)行試驗(yàn)樣品分析,部分蛤訐內(nèi)容可以在后續(xù)階段完成（如長(zhǎng)期

穩(wěn)定性）。根據(jù)已驗(yàn)證的分析方法處理試驗(yàn)樣品、質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣。一個(gè)分析批由空白

樣品（不含受試物和內(nèi)標(biāo)的處理后樣品）、零濃度樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理基質(zhì)）、至少3個(gè)濃

度水平質(zhì)控樣品（低、中、高濃度雙樣品，或至少試驗(yàn)樣品總數(shù)的5%,兩者中取數(shù)目更多

者）以及待分析的試驗(yàn)樣品。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個(gè)分析批中，以保證整個(gè)分析批的準(zhǔn)確

度和精密度。確保質(zhì)控樣品始終能覆蓋試驗(yàn)樣品。

校正標(biāo)桿和質(zhì)控樣品應(yīng)使用單獨(dú)配制的儲(chǔ)備液分別制備，除非儲(chǔ)備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性

已得到驗(yàn)證。所有樣品（校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和試驗(yàn)樣品）應(yīng)按照擬分析順序在同一處埋批

中處理和提取。同一處理批試驗(yàn)樣品和質(zhì)控樣品在固定時(shí)間段內(nèi)由同一組分析人員在使用相

同試劑、保證相同條件的情況下統(tǒng)一處理。

除LLOQ外，校正標(biāo)樣的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±15%以?xún)?nèi)，LLOQ應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。

至少75%且不少于6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣應(yīng)滿足該標(biāo)淮。如果采用的校正標(biāo)樣濃度超過(guò)6

個(gè)且其中一個(gè)不滿足標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)拒絕該校正標(biāo)樣，重新訂算不含該點(diǎn)的校準(zhǔn)曲線并進(jìn)行新的

回歸分析。

質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)。至少2/3且每一濃度水平至少50%

的質(zhì)控樣品應(yīng)滿足這一標(biāo)準(zhǔn)，若不滿足，則應(yīng)拒絕該分析批。相應(yīng)的試驗(yàn)樣品應(yīng)該重新處理

和分析。

含有稀釋復(fù)測(cè)樣品的分析批應(yīng)包含稀釋質(zhì)控，以驗(yàn)證試驗(yàn)樣品分析過(guò)程中稀釋方法的準(zhǔn)

確度和精密度。