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中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I1貓白血病病毒核酸檢測方法本文件適用于貓白血病病毒感染貓的血液中病毒核NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范4縮略語FeLV：貓白血病病毒（FelineleukaemiaviruRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscriptionPolymeraTaq酶：耐熱DNA聚合酶（ThermusAquaticusPolyme5.1儀器25.2耗材脈采集200~300μL血液。樣品編號并填寫相應(yīng)采樣單，樣品盡快送檢，送檢時檢測的樣本置于-70℃或以下保存，如無3R取6.4.1步驟反轉(zhuǎn)錄的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，PCR反應(yīng)體系及參數(shù)見附加樣：分別取10μLDNAMarker、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、陰陰性對照：PCR產(chǎn)物無核酸和在實驗有效的前提下，被檢樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在44配備熒光定量PCR擴(kuò)增試劑，根據(jù)被檢樣品數(shù)量，按照推薦的反應(yīng)液配方（見附錄C.2）配制反應(yīng)），到20μL，同時設(shè)立陰陽性對照孔，記錄反應(yīng)管對應(yīng)的樣品編合的檢測通道讀取熒光信號值，淬滅基團(tuán)選擇none。推薦的熒可疑5試劑配方稱量Tris24.2g，Na2EDTA·2H2O3.72g于1L燒杯中。向燒杯中加入約600mL無菌蒸餾水，充分?jǐn)嚪Q量Tris54.0g，EDTA2.9mg于1L燒杯中。向燒加入硼酸27.5g，充分?jǐn)嚢瑁患訜o菌蒸餾水定容至1L后，室溫保存。使用時稀釋5倍即1×TBE。A.3核酸凝膠制備6引物序列5’-3’工作液終濃度(μmol/L）體積(μL）\Pol_R\2\7\117引物序列5’-3’FAM-CCAGCAGTCTCCAGGCTCCCCA-BH終濃度(μmol/L）體積(μL）\酶\\2\\118D.1FeLVPCR陽性對照質(zhì)粒序列（GenD.2FeLV熒光PCR陽性對照質(zhì)粒序列（GenB5’-AACAGCAGAAGTTTTCAAGGCCGCTAC按照D.1和D.2中的序列合成基因片段，分別克隆至pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別構(gòu)建FeLVPCR和熒光PCR陽性對照重組質(zhì)粒，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測和測序分析，結(jié)果正確的為陽性重組質(zhì)粒。利用超微量分光光度計測定陽性重組質(zhì)粒濃度，并將濃度換算成拷貝數(shù)（DNA拷照母液。將陽性
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