T-LTIA 26-2024 基于SeqFD技術(shù)的物種鑒定技術(shù)規(guī)范

基于SeqFD技術(shù)的物種鑒定技術(shù)規(guī)范2024-09-12發(fā)布2024-10-01實施I Ⅱ 1范圍 1 13術(shù)語和定義 14縮略語 15技術(shù)原理 16試劑或材料 26.1DNA提取試劑盒 26.2采樣 26.3PCR試劑 2 27儀器設(shè)備 2 38.1操作要求 38.2實驗條件 3 3 38.5SeqFD測序文庫構(gòu)建 3 3 3 4 4 49結(jié)果分析 49.1結(jié)果計算 49.2結(jié)果判定 4附錄A(規(guī)范性)DNA提取和文庫構(gòu)建實驗步驟 5A.1實驗步驟 5附錄B(資料性)引物序列 6附錄C(資料性)PCR擴增體系 8附錄D(資料性)PCR擴增程序 9 本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由深圳市生命科技產(chǎn)學(xué)研資聯(lián)盟提出并歸口。本文件起草單位：海南大學(xué)三亞南繁研究院、深圳華大生命科學(xué)研究院、深圳華大智造科技股份有限公司、海南省種業(yè)實驗室、海南大學(xué)三亞研究院、武漢華大生命科學(xué)研究、三亞海古紀生物科技有限公司、深圳市生命科技產(chǎn)學(xué)研資聯(lián)盟。本文件主要起草人：夏志強、李小強、周紅梅、李啟沅、吳靜靜、華聰、鄒枚伶、魏曉鋒、游麗金王偉文、李濤、余樂俊、夏勉、黃河飛、孫建波、何沛欣、王博、王逸叢、謝偉、武慶超、駱順、李陶本文件的發(fā)布機構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及到條款8.4和條款8.5中SeqFD技術(shù)和文庫構(gòu)建相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利特有人已向本文件的發(fā)布機構(gòu)承諾，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)專利持有人姓名：夏志強、鄒枚伶、王文泉。地址：海南省三亞市崖州區(qū)海南大學(xué)三亞南繁研究院。請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責1基于SeqFD技術(shù)的物種鑒定技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了基于SeqFD測序技術(shù)物種鑒定的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、實驗步驟、結(jié)果分析.本文件適用于與農(nóng)業(yè)相關(guān)的植物和動物樣本，如水稻、木薯、甘蔗、馬鈴薯、豬和牛等物種鑒定。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款.其中，注日期的引用文件僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T37874核酸提取純化方法評價通則GB/T38551植物品種鑒定MNP標記法GB/T38570植物轉(zhuǎn)基因成分測定目標序列測序法GB/T42751—2023信息技術(shù)生物特征識別高通量測序基因分型系統(tǒng)規(guī)范GB/T42751—2023界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術(shù)，通常一次測序反應(yīng)能產(chǎn)生不低于100M堿基對的測序數(shù)據(jù)。指在DNA序列中，某一位置上可以是多種可能的堿基之一，用于設(shè)計能夠結(jié)合多個相似序列的引物。這種設(shè)計增加了引物的通用性，使其能夠識別含有序列變異的多個目標。SeqFD是一種極致簡化、全基因組覆蓋、高通量的DNA測序文庫制備和基因分型方法。下列縮略語適用于本文件.BLAST:局部相似性基本查詢工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyriboNucleicAcid)NCBI:美國國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterForBiotechnologyInformation)PCR:聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)設(shè)計含有簡并堿基的引物，構(gòu)建樣本基因組測序文庫，利用多重聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行文庫擴增和高通量測序，分析測序數(shù)據(jù)，獲得比對結(jié)果和鑒定結(jié)論。2通過使用含有簡并堿基的引物，構(gòu)建樣本基因組測序文庫，進行高通量測序。引物的核心部分由4個穩(wěn)定不變的堿基構(gòu)成。另外，為了增加引物的靈活性和適應(yīng)性，設(shè)計中還包括了3個可變化的堿基 (NWNNYN的組合),形成了所謂的彈性序列。這種設(shè)計使得引物能夠適應(yīng)并結(jié)合到基因組中的多種不同序列，從而增加了測序的廣度和深度。這些堿基構(gòu)成的引物能夠結(jié)合基因組的內(nèi)含子、編碼序列、NT數(shù)據(jù)庫中的序列進行快速比對，找出潛在的匹配區(qū)域，然后計算這些區(qū)域的相似性得分，返回評分最高的匹配序列。統(tǒng)計匹配序列歸屬的物種，并通過本文件的6試劑或材料6.2采樣6.3PCR試劑6.4引物6.4.2引物和樣本對應(yīng)關(guān)系宜根據(jù)樣本數(shù)量和實驗批次數(shù)選擇。若只進行1批測序，則物種來源不同的待測樣本份數(shù)不得大于96份，每份樣本對應(yīng)不同的引物編號；若選擇多批測序，則物種來源不同的本進行至少3次技術(shù)重復(fù)?！咄繙y序儀(測序300nt~700nt長度片段);——離心機(TGL-20M,轉(zhuǎn)速2000r/min);38.1.1樣品準備、DNA提取、PCR擴增應(yīng)按照條款6.1、6.2和6.3要求準備材料且規(guī)范化儀器操作。8.2.2實驗過程中應(yīng)戴好口罩、穿戴實驗服、橡膠手套，謹防吸入口鼻同時也避免外源DNA的污染。8.3.2樣本宜為植物較為幼嫩且新鮮的葉、根、莖等器官或組織，可為果實或種子；或是新鮮的動物文庫構(gòu)建主要包括DNA濃度均一化、96孔板加樣、離心、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳等5個步驟測序數(shù)據(jù)分析環(huán)境的搭建主要分為兩部分：在NCBI下載BLAST工具和安裝，下載NT庫后使用注1:NCBI網(wǎng)址為/blast/db/.注2:BLAST工具下載的網(wǎng)站為https//blast,版本號：2.13.0.注3:NT庫下載地址為/blast/db/FASTAnt.gz注：fastp軟件版本號為0.20.應(yīng)根據(jù)要求進行測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，要求具體見表1.類別30%～50%之間重復(fù)率°4表1測序數(shù)據(jù)質(zhì)量要求(續(xù))類別Q30值是指測序數(shù)據(jù)中堿基錯誤率在千分之一以下的比GC含量是指測序數(shù)據(jù)中G和C堿基的比例。重復(fù)率是是指測序數(shù)據(jù)中重復(fù)的堿基對的比例。8.9BLAST比對5DNA提取和文庫構(gòu)建實驗步驟A.1實驗步驟A.1.1.2實驗過程中使用到的PCR板等儀器應(yīng)滅菌后再使用。A.1.2實驗條件A.1.2.1實驗室保持干凈整潔，避免污染A.1.2.2實驗過程中戴好口罩、穿戴實驗服、橡膠手套，謹防吸入口鼻同時也避免外源DNA的污染。A.1.3取樣A.1.3.2取材后立即液氮速凍，保存于液氮或超低溫冰箱中。A.1.3.3若為-80℃冰箱保存的樣品，研磨前應(yīng)避免樣品化凍變軟，研磨過程中也保持低溫。A.1.4DNA提取DNA提取主要包括細胞裂解、細胞沉淀、洗滌、純水/TE溶液純化收集等4個步驟。DNA提取應(yīng)a)將純化收集后的樣品DNA進行濃度均一化，濃度建議控制在100ng/μL左右；b)將DNA、引物(引物序列見附錄B)、混合液加入96孔板中(擴增體系見附錄C),實驗操作過程需全程在低溫環(huán)境(0℃~20℃)下進行；c)加樣結(jié)束后對96孔板放進行離心，將離心后的樣品放入PCR儀中進行擴增(擴增程序見附錄d)對擴增后的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，電壓50V,時間設(shè)置40min;將300bp~700bp的時間保存應(yīng)在-20℃保存。6(資料性)引物序列引物序列見表B.1。表B.1引物序列序號引物(從5′端到3′端；Forward-Reverse)1TAGCTCGACACTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG2TAGCTCTGGAATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG3TAGCTCGAACAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG4TAGCTCGGCATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG5TAGCTCCCGCTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG6TAGCTCGACATACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG7TAGCTCCGACAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG8TAGCTCTGGTGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG9TAGCTCTTAGCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGTGCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAAGACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCTTCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCGAAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCTCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGGTAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTCGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTTAACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCCACACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTTTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTCCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACTTCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCGTTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGATTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCAATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGCGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGATTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTCCATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCAGCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAACCGCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGATCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCCCAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTGAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCGGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTCTAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAATCTGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTACGTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGAACTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCACTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTAAGTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGATGACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG7表B.1引物序列(續(xù))序號引物(從5'端到3′端；Forward-Reverse)TAGCTCTCGTTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAACCTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACAATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTACAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGCTTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCATACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGACGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCTGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTGCCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATTACGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGTGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAACGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTATCGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTGCTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGTATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGAGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTACAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCTTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCATCCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTACCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCATTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACTCCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCCGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCCTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCTACCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACACCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTCAACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGATCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCAGTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTAGATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAACTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCTGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGAATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTGGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGTCATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCCGCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATCATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGGTCACAAACC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