超高效液相色譜法檢測大豆異黃酮含量

大豆異黃酮（CatheRineGenistein）是黃酮類化合物的一種，它作為一種次生代謝產(chǎn)物，形成于大豆植物體生長過程。大豆異黃酮結(jié)構(gòu)與雌激素相似，因此又稱植物雌激素[1]。大豆異黃酮不僅具有明顯的抗氧化作用，而且還可以起到預(yù)防骨質(zhì)疏松、多種癌癥、心血管疾病等功效[2]。大豆異黃酮母核為3-苯并吡喃酮，以游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷形式存在[3]。糖苷占大豆異黃酮總量的97%～98%，苷元僅占大豆異黃酮總量的2%～3%。糖苷主要有大豆苷（daidzin）、料木苷（genistin），苷元主要有染料木素（genistein）、大豆苷元（daidzein）[4]。目前，紫外吸收法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-7]是大豆異黃酮的主要檢測方法。其中，紫外吸收法靈敏度不高，只能測定大豆異黃酮總量。氣相色譜法前處理復(fù)雜，需要對異黃酮進(jìn)行衍生。高效液相色譜法具有樣品分離度好、定量準(zhǔn)確、操作容易、處理簡單等優(yōu)點[6]。因此，本文建立一種超高效液相色譜法，用于測定大豆中大豆異黃酮含量，以提供一種快速簡便、靈敏度高的大豆異黃酮含量檢測方法。1材料與方法1.1材料與試劑大豆（市購），粉碎備用。大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）（純度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈，Merck公司，為色譜純；乙酸，Merck公司，為分析純；超純水，一級水。1.2儀器與設(shè)備ACQUITYUltraPerformanceLC超高效液相色譜儀，Waters公司；2998PhotodiodeArrayDetector光電二極管陣列檢測器，Waters公司；渦旋混合器，IKA公司；超聲波儀，寧波東和超聲波科技有限公司；恒溫干燥箱，上海宏泰儀器設(shè)備廠；高速離心機(jī)，HITACHI公司；分析天平，OHAUS公司；PURELABChorus超純水機(jī)，ELGA公司。1.3試驗方法1.3.1標(biāo)準(zhǔn)工作液配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液：用分析天平準(zhǔn)確稱取大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷0.01g，置于100mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解，并定容至刻度，制成0.1mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用時，根據(jù)實際需要，對標(biāo)準(zhǔn)儲備液用進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐舛认♂?，得到?biāo)準(zhǔn)工作液，保存于冰箱中備用。1.3.2樣品處理用分析天平準(zhǔn)確稱取試樣10g，精確到0.01g，將試樣置于100mL離心管中。加入70%甲醇定容，渦旋混合60s，超聲波儀中振蕩20min，然后放入離心機(jī)內(nèi)，在離心機(jī)中以9000r·min-1離心5min，取離心上清液，移至100mL容量瓶中。用0.45μm濾膜過濾，加入70%甲醇補(bǔ)至相應(yīng)刻度。吸取10mL樣品，將其置于100mL離心管中，恒溫干燥箱濃縮至干，用乙腈-0.2%乙酸溶液將濃縮樣品定容至5mL，再用0.45μm濾膜過濾，移至進(jìn)樣瓶中。1.3.3色譜條件色譜柱為WatersACQUITYUPLCBEHCC18柱[8]（150mm×2.1mm，1.7μm），進(jìn)樣量為5μL；流速為0.15mL·min-1；經(jīng)全波長掃描大豆異黃酮成分，并比較了不同波長的峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在260nm波長處靈敏度高，因此檢測波長選擇260nm；大豆異黃酮的保留值和分離度都受柱溫的影響，為了避免柱溫較高，縮短保留時間，選擇30℃柱溫；由于大豆異黃酮極性較弱，為實現(xiàn)完全分離，通過研究乙腈和不同濃度的乙酸對大豆異黃酮成分保留值和分離度的影響，流動相選用乙腈-0.2%乙酸，梯度洗脫條件如表1所示。表1分離梯度程序表2結(jié)果與分析2.1線性關(guān)系及檢出限吸取一定量的大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇水溶液將其稀釋成1.0μg·mL-1、3.0μg·mL-1、5.0μg·mL-1、7.0μg·mL-1、9.0μg·mL-1以及0μg·mL-1的溶液，經(jīng)處理后進(jìn)行測定，每個大豆異黃酮成分重復(fù)測定3次。設(shè)定濃度為橫坐標(biāo)X，大豆異黃酮成分3次測定峰面積平均值為縱坐標(biāo)Y，對其進(jìn)行線性回歸，得到大豆異黃酮成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示。線性檢測范圍均為1.0～9.0μg·mL-1。表2大豆異黃酮成分標(biāo)準(zhǔn)曲線表2.2精密度試驗分別精密吸取同一標(biāo)準(zhǔn)工作液，連續(xù)平行進(jìn)樣5次，測定4種大豆異黃酮成分的峰面積，如表3所示。大豆苷的RSD為0.28%，大豆苷元的RSD為0.22%，染料木素的RSD為0.32%，染料木苷的RSD為0.26%，結(jié)果表明儀器精密度良好。表3大豆異黃酮成分精密度表2.3穩(wěn)定性試驗在樣品溶液中，加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，每隔4h進(jìn)一次樣，進(jìn)樣6次，測定4種大豆異黃酮成分的峰面積，如表4所示。大豆苷的RSD為0.33%，大豆苷元的RSD為0.25%，染料木素的RSD為0.88%，染料木苷的RSD為0.46%，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)工作液在24h內(nèi)穩(wěn)定。表4大豆異黃酮成分穩(wěn)定性表2.4回收率試驗回收試驗時，在樣品溶液中，準(zhǔn)確加入大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷的標(biāo)準(zhǔn)工作液，重復(fù)進(jìn)樣5次，得到4種大豆異黃酮成分的回收率，如表5所示。結(jié)果表明，大豆苷回收率為97.6%，RSD為1.8%；大豆苷元回收率為98.2%，RSD為1.7%；染料木素回收率為98.6%，RSD為2.1%；染料木苷回收率為97.6%，RSD為1.4%。表5大豆異黃酮成分回收率表2.5樣品測定精確吸取樣品溶液5μL，對大豆異黃酮含量進(jìn)行檢測，計算得出大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷含量，具體如表6所示。表64種大豆異黃酮含量表3結(jié)論大豆異黃酮在我國藥品、保健品、食品等行業(yè)應(yīng)用廣泛，為滿足日常大豆異黃酮檢測的需求。通過試驗建立了一種超高效液相色譜法檢測方法，用于測定大豆中大豆異黃酮的含量，該超高效液相色譜法采用BEHCC18色譜柱，能夠在較大的樣品流量下，保證色譜柱的柱效，實現(xiàn)快速分離，并保證峰形尖