液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定嬰幼兒奶粉中左旋肉堿含量不確定度評(píng)定

左旋肉堿又稱L－肉堿，是一種促進(jìn)人體脂肪轉(zhuǎn)換為動(dòng)能的類碳水化合物，不僅可用于減肥類的保健食品，也可用于嬰幼兒食品。奶粉中的左旋肉堿是促進(jìn)奶粉中的脂肪分解、代謝、供能的重要營(yíng)養(yǎng)素，可以促進(jìn)體內(nèi)脂肪的代謝和利用。嬰幼兒飲食結(jié)構(gòu)比較單一，其主要飲食來(lái)源為各種乳制品，主要能量來(lái)源為乳制品中的脂肪。添加左旋肉堿，可以提高嬰幼兒對(duì)奶粉中脂肪的利用率[1]。因此，本文依據(jù)SN/T5146—2019第二法[2]液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒奶粉中左旋肉堿的含量。同時(shí)，分析嬰幼兒奶粉中的左旋肉堿含量不確定度，以供參考[3]。1材料與方法1.1試劑乙腈（色譜純，Merck）；甲醇（色譜純，Merck）；氨水（AR，湖南匯虹）；鹽酸（GR，國(guó)藥集團(tuán)）；甲酸（HPLC，科密歐），左旋肉堿（壇墨，批號(hào)2362012；含量99.90%；U=0.5%）；D3-左旋肉堿（TRC，批號(hào)：5-BKS-60-2）。1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稱取左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品7.30mg，乙腈溶解，配制成濃度為729.27μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4℃以下避光保存。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)中間液準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（729.27μg·mL-1）0.10mL，用乙腈稀釋至10mL，搖勻，制成7.2927μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液，4℃以下避光保存。1.2.3D3-左旋肉堿內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品5.00mg，用乙腈溶解，配制成濃度為500μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃以下避光保存。1.2.4D3-左旋肉堿內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液準(zhǔn)確吸取D3-左旋肉堿內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500μg·mL-1）0.20mL，用乙腈稀釋至10mL，搖勻，制成10μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液，4℃以下避光保存。1.2.5標(biāo)準(zhǔn)工作液準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用0.1%甲酸水溶液溶解并稀釋，配制成內(nèi)標(biāo)濃度為100ng·mL-1，以及左旋肉堿濃度分別為0.3646、1.8232、18.2312、72.927、145.854、364.635ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3儀器與設(shè)備AB-3500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB）；十萬(wàn)分之一電子天平（XS205，梅特勒）；萬(wàn)分之一電子天平（AR224CN，奧豪斯）；ASE-12固相萃取裝置；TG18G-Ⅱ離心機(jī)；WD-12氮吹儀；SHA-C(A）恒溫水浴振蕩器；SPE固相萃取柱（OasisMCX柱，60mg/3mL，Waters）。1.4測(cè)定方法1.4.1樣品提取與凈化稱取試樣1g→50mL離心管→加內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液100μL→加入20mL的0.1mol·L-1鹽酸溶液→搖勻，超聲5min→加入5mL的1mol·L-1氫氧化鉀溶液，混勻→60℃水浴皂化30min→冷卻至室溫→加5mL的1mol·L-1鹽酸溶液→渦旋1min→移至50mL容量瓶→用0.1mol·L-1鹽酸溶液潤(rùn)洗離心管，合并潤(rùn)洗液至容量瓶→用0.1mol·L-1鹽酸溶液定容至刻度→取1.00mL提取液于15mL離心管→加入9.0mL乙腈→渦旋混勻1min→離心→取1.00mL上清液過(guò)OasisMCX固相萃取小柱（依次使用3mL甲醇、3mL水和3mL10mmol·L-1鹽酸活化）→用3mL的10mmol·L-1鹽酸溶液淋洗→棄去淋洗液→抽干小柱→加2mL4%氨水甲醇溶液洗脫→收集洗脫液→40℃氮吹干→加入1.0mL0.1%甲酸水溶液溶解殘?jiān)^(guò)0.22μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線建立以左旋肉堿和D3-左旋肉堿濃度比為橫坐標(biāo)，左旋肉堿和D3-左旋肉堿內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5建立數(shù)學(xué)模型式中，X為樣品中左旋肉堿的含量，mg·kg-1；V為樣品定容體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g；1000為換算系數(shù)。1.6不確定度來(lái)源的識(shí)別對(duì)過(guò)程分析可知，左旋肉堿含量測(cè)定的不確定度主要有以下4個(gè)方面[4]：樣品稱量過(guò)程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）；樣品測(cè)試液中左旋肉堿濃度引入的不確定度urel（C）；樣品稀釋體積引入的不確定度urel（V）；重復(fù)性引入的不確定度urel（r）。2不確定度分量的評(píng)定與合成2.1A類不確定度重復(fù)性引入的不確定度urel（r），主要受操作過(guò)程、樣品特性和儀器本身性能等因素的影響，獨(dú)立測(cè)定6次，結(jié)果如下：35.88、36.27、36.59、35.57、36.59、36.50mg·kg-1。6次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)偏差：實(shí)際檢測(cè)時(shí)，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)不確定度：重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：2.2B類不確定度2.2.1樣品稱量過(guò)程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）樣品平均質(zhì)量為1.0344g，稱量范圍內(nèi)的最大允許誤差為±0.5mg，按均勻分布考慮（k=），則稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：2.2.2樣品測(cè)試液中左旋肉堿濃度引入的不確定度urel（c）（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)不確定度分量urel（C1）。對(duì)6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各進(jìn)樣1次，共計(jì)6次，得到左旋肉堿峰面積A1和D3-左旋肉堿A2，結(jié)果見表1。表1左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程數(shù)據(jù)表以左旋肉堿和內(nèi)標(biāo)濃度之比為橫坐標(biāo)，左旋肉堿峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為：Y=2.15416X+0.00759，相關(guān)系數(shù)R=0.9999。標(biāo)液中左旋肉堿和內(nèi)標(biāo)濃度之比的平均值：峰面積比值的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差：對(duì)被測(cè)樣品的提取液共測(cè)量1次，即p=1，測(cè)得提取液中左旋肉堿濃度和D3-左旋肉堿濃度比值X=0.72868。于是其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（c1）：（2）儲(chǔ)備液與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制引入的不確定度urel（c2）。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)的不確定度主要來(lái)源為標(biāo)準(zhǔn)品的稱量、標(biāo)準(zhǔn)品純度和定容。①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度urel（c21）本次使用的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的證書標(biāo)識(shí)純度為99.90%；urel=0.5%，則urel（c21）=0.005；D3-左旋肉堿帶入的不確定度不予考慮。②標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度urel（c22）本次左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品配制時(shí)采用的是十萬(wàn)分之一電子天平，其質(zhì)量為7.30mg，該天平準(zhǔn)確度等級(jí)為Ⅰ級(jí)，在（0g≤m≤50g）稱量范圍內(nèi)的最大允許誤差為±0.05mg，可按均勻分布考慮（k=），則標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：③標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程量器具及溫度變化引入的不確定度urel（c23）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、中間液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制中，均用到了移液槍和容量瓶，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的移液槍經(jīng)校準(zhǔn)合格，玻璃量器具均為A級(jí)，根據(jù)其最大允差計(jì)算；實(shí)驗(yàn)室溫度在±5℃范圍內(nèi)變動(dòng)，溫度對(duì)體積的影響可以通過(guò)體積膨脹系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。因溶液的體積膨脹系數(shù)大于容量瓶體積的膨脹，故只考慮前者的影響。水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，均假設(shè)為三角分布，各量器具帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：合成，得到：將以上3個(gè)分量進(jìn)行合成，urel（c2）為：2.2.3樣品稀釋體積引入的不確定度urel（V）本實(shí)驗(yàn)樣品處理過(guò)程中，用到50mL容量瓶（A級(jí)）1次，1mL移液槍移取1.00mL溶液3次，10mL刻度移液管（A）移取9.0mL溶液1次，按照J(rèn)JG196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[5]和JJG646—2006《移液器檢定規(guī)程》[6]的要求，按三角分布考慮，則由量器具體積不準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下。50mL容量瓶（A級(jí)）體積不準(zhǔn)帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：10mL刻度移液管（A級(jí)）量取9.0mL體積不準(zhǔn)帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：1mL移液槍量取1.00mL體積不準(zhǔn)帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：由量器具帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：2.3相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展2.3.1不確定度的合成根據(jù)以上結(jié)果，將urel（m）、urel（c）、urel（V）、urel（r）進(jìn)行合成，即2.3.2不確定度的擴(kuò)展擴(kuò)展不確定度是標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）乘以包含因子k。取包含因子P95=2，則所測(cè)結(jié)果擴(kuò)展不確定度：U=2×1.18mg·kg-1=2.36mg·kg-1。3結(jié)論嬰幼兒奶粉中