（高清版）DB12∕T 653-2016 鮮凍畜、禽肉中動(dòng)物源性成分的定量檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法　　

B45DB12QuantitativePCRmethod天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙新、易萌、劉娜、蘭青闊、劉雪巖、陳銳、朱珠、王成、徐石鮮凍畜、禽肉中動(dòng)物源性成分的定量檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)時(shí)熒光PCRrealtimePCR每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的豬源性成分porcine-derive雞源性成分chicken-derive算試樣中種屬特異性基因和內(nèi)參基因的比值，從而對(duì)鮮凍畜、禽肉中動(dòng)物源性成分進(jìn)行定量檢測(cè)。Rd1Rd1-P：5′-FAM-CGGCACSus-ACTBSus-P：5′-FAM-TCTGDucg作為試樣，裝入清潔容器中，加封后，標(biāo)明標(biāo)記。將試樣于-20℃冷凍保存。SDS裂解液和20μL蛋白酶K（20mg/mL混勻，55℃水浴消化數(shù)小時(shí)，期間不停顛倒混勻，直至緩慢顛倒混勻，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至一5.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣實(shí)時(shí)熒光P進(jìn)行45次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（95℃變性15s，60℃退火延伸1min在第二階段的退火延伸（60℃)時(shí)段收集熒光信號(hào)。4—2.0μL2.0μL—25.0μL—1.0μL1.0μL0.5μL1.0μL—25.0μL情況進(jìn)行調(diào)整。設(shè)定閾值處，要求不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線平行，而且同一樣品的不同平根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的擴(kuò)增Ct值和初始模板含量的對(duì)數(shù)間的線性關(guān)系，分別繪制動(dòng)物源性標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：式中：y—測(cè)試樣品的Ct值；a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；x—模板靶標(biāo)濃度以10為底數(shù)的對(duì)數(shù)；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。5.3.5.4數(shù)據(jù)可接受的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物源性成分種屬特異性基因陰性對(duì)照和空白對(duì)照的Ct值≥38;16SrDNA陰性對(duì)照和空白對(duì)照的16SrDNA內(nèi)標(biāo)基因Ct值≥38;標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.98,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率≥-3.6且≤-3.1,滿足上述條件，可以進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。否則重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。5.3.5.5含量計(jì)算5.3.5.5.1計(jì)算試樣模板靶標(biāo)濃度將試樣的動(dòng)物源性成分種屬特異性基因和16SrDNA內(nèi)參基因的Ct值分別帶入動(dòng)物源性成分種屬特異性基因和16SrDNA內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算動(dòng)物源性成分種屬特異性基因和16SrDNA內(nèi)參基因的靶標(biāo)濃度。計(jì)算試樣模板靶標(biāo)濃度公式：式中：n—模板靶標(biāo)濃度y—測(cè)試樣品的Ct值；a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。5.3.5.5.2計(jì)算試樣中動(dòng)物源性成分種屬特異性基因含量將動(dòng)物源性成分種屬特異性基因的靶標(biāo)濃度和16SrDNA內(nèi)參基因的靶標(biāo)濃度帶入公式(3),計(jì)算出試樣中動(dòng)物源性成分種屬特異性基因百分含量。計(jì)算試樣中動(dòng)物源性成分種屬特異性基因百分含量的公式：式中：c—試樣中動(dòng)物源性成分種屬特異性基因的百分含量(%);Du一動(dòng)物源性成分種屬特異性基因靶標(biāo)濃度；6結(jié)果分析與表述6.116SrDNA內(nèi)參基因和動(dòng)物源性種屬特異性基因均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且16SrDNA內(nèi)參基因和動(dòng)物源性種屬特異性基因的Ct值<36,表明樣品中檢出某動(dòng)物源性成分。表述為“樣品中檢測(cè)出某動(dòng)物源性成分，某動(dòng)物源性成分含量為c”。依照6.1-6.2進(jìn)行判斷；如重復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物源性種屬特異性基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，但Ct值仍在36～38內(nèi)參基因和動(dòng)物源性種屬特異性基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，但Ct1GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGCTACTTCTGTGAGGCAGA61GCTGTGTTCCTTGCCGTCATGTGCCCAGGAGACTGGCGGGGAAGGAAGAGACTGGCGGGGAAGGAA61ACAGAGCGAGTCAGAAGGCT注：劃線部分為OA-F和OA-R引物序列，方61AGCACACTTAGCCGTGTTCCTTGCACTCTCTGCATATATCCACGGTT