（高清版）DB12∕T 505-2014 玉米轉(zhuǎn)基因成分篩查方法　

DB12DB12/T505—2014玉米轉(zhuǎn)基因成分篩查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedmaize2014-04-22發(fā)布2014-07-20實施天津市質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布本標準2014年04月首次發(fā)布。本標準規(guī)定了玉米中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR篩查的術語本標準適用玉米及其制品中zSSIIb基因、HPT基因的定性PCR篩查檢測GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣zSSIIb基因zSSIIbgeneCaMV35S啟動子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）NOS終止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）geneBt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene來源與蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthur），見的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/crybar基因bialaphosresistanceacetyltransferase，PHPT基因HPTgene來源于大腸桿菌或鏈球菌（Streptomyceshygroscopicus編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycin4檢測方法4.1.1實驗用水為重蒸餾水或符合GB/），注：溴化乙錠有致癌作用，配制和使用時應戴），）：）：），），4.1.9加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍，加10mL水，在室溫下溶解12h；稱取250.0mg二甲基苯腈藍，用10mL水溶解；稱取50.04.1.13引物：玉米內(nèi)標準基因和轉(zhuǎn)基因玉米zSSIIbCaMV35SNOSBtbarbar-F：5′-GAAGGCACGCAACGCCTAbar-R：5′-CCAGAAACCCACGTCATGC262bpHPThpt-F：5′-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-hpt-R：5′-AGATGTTGGCGACCTCGTA472bp按NY/T672和農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013規(guī)定的執(zhí)行。按NY/T672和農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013規(guī)定的執(zhí)行。水2.5μL25mmol/L氯化鎂溶液2.0μL0.25～1.25μL0.25～1.25μL0.025U/μL2.0μL25.0μL測反應體系中，上、下游引物分別是bar-F和bar-R，引物終濃度分別為0.2μmol/L；HPT基因PCR檢測反應體系中，上下游引物分別是hpt-F和hpt-R，引物終濃度分別為0.zSSIIbNOSBtbarHPT4.3.5.1.5反應結(jié)束后取出PCR管，對PCR反應產(chǎn)物進行電泳檢測。各對照PCR反應體系中，除模板外，其余組分及PCR反應條件與4.3.5.1相同。mL瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插固成凝膠后，放入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板。取12μLPCR產(chǎn)物與3μL加樣緩沖液條件下電泳檢測。擴增片段是否為目的DNA片段，按照4.3.8和4.3.9的規(guī)定執(zhí)行。將回收的PCR產(chǎn)物克隆測序，與玉米內(nèi)標準基因zSSIIb、5.2.1在試樣的PCR反應中，內(nèi)標準基因得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致；而CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt基因、bar基因和HPT基因均未得到擴增，或擴增片段大小與預A.2CaMV35S啟動子PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列