牛人工授精技術(shù)規(guī)程

1DB43/TXXXX—2022牛人工授精技術(shù)規(guī)程本文件牛冷凍精液人工授精的操作技術(shù)要求、記錄。本規(guī)程適用于我省母牛人工授精技術(shù)應(yīng)用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4143牛冷凍精液GB/T5458液氮生物容器NY/T1234牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1335牛人工授精技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1冷凍精液frozensemen將原精液用稀釋液等溫稀釋、平衡后快速冷凍，在液氮中保存。冷凍精液指細(xì)管冷凍精液。3.2冷凍精液解凍thawingoffrozensemen冷凍精液使用前使冷凍精子重新恢復(fù)活力的處理方法。3.3人工授精artificialinsemination用人工方法采取公牛精液，經(jīng)檢查處理后，輸入發(fā)情母牛生殖道內(nèi)，使其受胎的技術(shù)。3.4發(fā)情鑒定estrusdetection通過外部觀察或其他方式確定母牛發(fā)情程度的方法。3.5情期受胎率conceptionrateofsaneinsemination同期受胎母牛數(shù)占同期輸精情期數(shù)的百分比。3.6受胎率conceptionrate同期受胎母牛數(shù)占同期參加輸精母牛數(shù)的百分比。3.7繁殖率reproductiverate2DB43/TXXXX—2022同期分娩母牛數(shù)占同期應(yīng)繁殖母牛數(shù)的百分比。4牛基本條件4.1種公牛和精液品質(zhì)應(yīng)符合GB/T4143的要求。4.2母牛健康、繁殖機(jī)能正常的未妊娠母牛。5輸精準(zhǔn)備5.1器具清洗和消毒凡是接觸精液和母牛生殖道的輸精用器具都應(yīng)進(jìn)行清洗和消毒（見附錄A）。5.2冷凍精液的貯存冷凍精液應(yīng)浸泡在液氮生物容器中貯存，液氮生物容器應(yīng)符合GB/T5458有關(guān)規(guī)定。包裝好的冷凍精液由一個被氮容器轉(zhuǎn)換到另一液氮容器時，在被氮容器外停留時間不得超過5s。5.3冷凍精液解凍冷凍精液的解凍方法應(yīng)符合GB/T4143的要求。5.4精液質(zhì)量檢查精液質(zhì)量應(yīng)符合GB/T4143的要求。5.5牛體衛(wèi)生輸精前，用于掏凈母牛直腸宿糞后，再用溫水清洗母牛外陰部并擦拭干凈。5.6輸精器準(zhǔn)備采用金屬輸精器。剪去細(xì)管精液封口，剪口應(yīng)正，斷面應(yīng)齊。將剪去封口的細(xì)管精液迅速裝入輸精器管內(nèi)，步驟為：剪去封口端的為前端，輸精器推桿后退，細(xì)管裝至管內(nèi)，輸精器管進(jìn)入塑料外套管，管口頂緊外套管中固定圈，輸精器管前推到頭，外套管后部與輸精器后部螺紋處擰緊，卡式的外套則要推入卡槽里，全部結(jié)合要緊密。6母牛發(fā)情鑒定6.1外部觀察3DB43/TXXXX—2022通過母牛的外部表現(xiàn)癥狀和生殖器官的變化判斷母牛是否發(fā)情和發(fā)情程度（見附錄B)。6.2直腸檢查通過直腸檢查卵巢，觸摸卵泡發(fā)育程度，判斷發(fā)情程度及排卵時間（見附錄B）。7輸精7.1輸精時間確定7.1.1觸摸卵泡在卵泡壁薄、滿而軟、有彈性和波動感明顯接近成熟排卵時輸精一次；6h-10h卵泡仍未破裂，再輸精一次。7.1.2外部觀察法母牛接受爬跨后6h-10h是適宜輸精時間。如采用兩次輸精，第二次輸精時間為母牛接受爬跨后12h-20h。青年母牛的輸精時間宜適當(dāng)提前。7.2直腸把握輸精法輸精人員一手五指并握，呈圓錐形從肛門伸進(jìn)直腸，動作要輕柔，在直腸內(nèi)觸摸并把握住子宮頸，使子宮頸把握在手掌之中，另一手將輸精器從陰道下口斜上方約45°角向里輕輕插入，雙手配合，輸精器頭對準(zhǔn)子宮頸口，輕輕旋轉(zhuǎn)插進(jìn)，過子宮頸口螺旋狀皺壁到達(dá)子宮體2cm-3cm即為輸精部位。一頭母牛應(yīng)使用一支輸精器或者一支消毒塑料輸精外套管。直腸把握輸精，使用金屬輸精器，注入精液前略后退約0.5cm，把輸精器推桿緩緩向前推，通過細(xì)管中棉塞向前注入精液。7.3輸精部位應(yīng)到子宮體部，即子宮頸后端與子宮角間溝分岔部中間部位，不宜深達(dá)子宮角部位。8妊娠檢查8.1外部觀察妊娠母牛外部表現(xiàn)發(fā)情周期停止，食欲增進(jìn)，毛色潤澤，性情變溫和，行為變安穩(wěn)。懷孕中后期腹國增大，腹壁一側(cè)突出，甚至可觀察到胎動，乳房脹大。輸精后二個情期未發(fā)情（40d左右通過直腸觸摸檢查子宮，可查出兩側(cè)子宮角不對稱，孕側(cè)子宮角較另側(cè)略大，且柔軟。60d后直腸觸摸可查出妊娠子宮增大、胎兒和胎膜。直腸觸摸同側(cè)卵巢較另4DB43/TXXXX—2022側(cè)略大，并有妊娠黃體，黃體質(zhì)柔軟、豐滿，頂端能觸感突起物。8.3超聲波診斷用B超檢查母牛的子宮及胎兒、胎動、胎心搏動等。對配種28d后的牛采血，用檢測試劑盒（PAG-ELISA）測定PAGs，按檢測試劑盒說明書操作，或見9記錄9.1記錄內(nèi)容包括母牛號、母牛發(fā)情時間、發(fā)情觀察鑒定、發(fā)情后期流血時間、輸精時間、公牛號及冷凍精液信息、輸精操作人員。上述內(nèi)容可以表格的方式記錄，見附錄D。9.2情期受胎率情期受胎率按式（1）計(jì)算。式（1）:F=F*I/I*100-----(1)式中：F----情期受胎率，%。F*I----同期受胎母牛數(shù)，頭。I----同期輸精情期數(shù)，頭.次。受胎率按式（2）計(jì)算。式（2):C=C1/I*100---------(2)式中：C----受胎率，%；C1----同期受胎母牛數(shù)，頭；I-----同期輸精母牛數(shù)，頭。9.4繁殖率繁殖率按式（4）計(jì)算。式（4):R=C/I*100---------(4)式中：5DB43/TXXXX—2022R-----繁殖率，%；C-----同期產(chǎn)犢母牛數(shù)，頭；I-----同期應(yīng)繁殖母牛數(shù)，頭。6DB43/TXXXX—2022（規(guī)范性附錄）輸精器具的清洗和消毒A.1玻璃器皿使用前用水浸泡和洗滌，有污物的宜用加洗滌劑的溫?zé)崴蛑亟j(luò)酸餌洗液浸泡數(shù)小時后，用水洗凈涼干備用。玻璃輸精管放置在電熱干燥箱160℃保持0.5h，自然冷卻后待用。A.2金屬器械金屬輸精器類洗凈后，置電熱干燥箱120℃保持lh，自然冷卻待用。7DB43/TXXXX—2022（資料性附錄）發(fā)情外部表現(xiàn)癥狀和生殖器官的變化母牛發(fā)情外部表現(xiàn)癥狀和生殖器官的變化見表B.l表B.1發(fā)情鑒定外部表現(xiàn)癥狀和生強(qiáng)器官的變化母牛母牛游走減少，其它牛爬跨時站立不動、后肢張開，頻頻舉血，黏液顯著增加，流出大量透明卵泡增大，波動明顯，泡壁由厚變薄8DB43/TXXXX—2022（資料性附錄）配種記錄表123459DB43/TXXXX—2022（規(guī)范性附錄）妊娠特異性糖蛋白（PAGs）診斷A.1采集血樣品用一次性采血針和5mL采血管，對配種28-30d的母牛尾根酒精消毒采血2mL-3mL,采血管做好標(biāo)記和填寫采樣單，靜置1小時，3000g離心10min，離心后血清可直接用于檢測，不立即檢測的血清轉(zhuǎn)入新的離心管，在-20℃冰箱內(nèi)保存。A.2準(zhǔn)備檢測用品準(zhǔn)備手套、吸管、洗瓶、移液槍、槍頭等，將試劑盒、樣品恢復(fù)至室溫，搖勻試劑。A.3加樣反應(yīng)A.3.1將微孔板置于平整干凈的臺面上，用吸管分別向微孔內(nèi)加入50μL緩沖液，再加標(biāo)準(zhǔn)品（陽性對照和陰性對照）和待測樣品150μL填寫加樣登記單，記錄下每個微孔的位置，確認(rèn)加樣準(zhǔn)確無誤。A.3.2用封口膜將微孔板密封以防蒸發(fā)，輕輕搖勻，在20℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育1小時。A.3.3孵育后，去掉膜，翻轉(zhuǎn)微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，再用洗液清洗微孔4次。A.3.4洗滌后，向微孔內(nèi)加入檢測溶液，輕輕搖勻，再在在20℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育1小時。A.3.5孵育后，重復(fù)步驟A.3.3的洗板過