基因工程的基本操作程序第2課時課件高二下學期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程第2節(jié)

基因工程的基本操作程序人教版·選擇性必修3基因表達載體的構(gòu)建獲得目的基因后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？

不是，游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因。獲得目的基因后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在且遺傳給下一代;使目的基因在受體細胞中能夠表達且發(fā)揮作用。1、基因表達載體的作用質(zhì)粒標記基因復制原點啟動子終止子限制酶切位點位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，具有驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的作用。位于基因下游，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來。供目的基因插入載體中便于重組DNA的篩選能夠在受體細胞中自我復制或整合到受體DNA上2、基因表達載體的組成3.基因表達載體構(gòu)建的流程同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割DNA連接酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因限制酶切割位點質(zhì)粒重組DNA分子限制酶限制酶限制酶限制酶DNA連接酶質(zhì)粒重組DNA分子目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。3.基因表達載體構(gòu)建的流程圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因(一般不全破壞)、啟動子、終止子、復制原點原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。基因表達載體的構(gòu)建(核心)1.區(qū)分啟動子和起始密碼子,終止子和終止密碼子啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達載體必需的部分，而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。2.區(qū)分載體、表達載體、重組質(zhì)粒載體≠表達載體二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。補充知識：基因結(jié)構(gòu)-----原核生物基因編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子①功能：不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段，調(diào)控遺傳信息的表達。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。編碼區(qū)：非編碼區(qū)：②組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游。上游有啟動子，下游有終止子。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)基因RNA聚合酶識別和結(jié)合位點，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄補充知識：基因結(jié)構(gòu)-----原核生物基因編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)AGGTCACGTCGATCGTCCAGTGCAGCTAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCGAUCG轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯多肽鏈補充知識：基因結(jié)構(gòu)-----真核生物基因編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。真核生物基因中的非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因不編碼蛋白質(zhì),能調(diào)控遺傳信息表達補充知識：基因結(jié)構(gòu)-----真核生物基因編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA前體加工（剪切、拼接）成熟mRNA翻譯多肽鏈真核細胞的一個基因的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄出mRNA前體，需把其中的內(nèi)含子切除，外顯子拼接成成熟mRNA。補充知識：基因結(jié)構(gòu)-----真核生物基因編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄mRNA前體加工（剪切、拼接）成熟mRNADNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄復制單鏈DNAcDNA不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點都有能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼非編碼序列=非編碼區(qū)原核基因：非編碼序列真核基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子成熟mRNA相應(yīng)酶去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）多肽鏈前體mRNA蛋白質(zhì)加工如果把一個真核生物的基因?qū)朐思毎斜磉_，一定會產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)嗎？提示：一般不能產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)原因：①原核生物細胞里沒有相應(yīng)的酶來去除內(nèi)含子；②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）提取如果把真核基因?qū)朐思毎斜磉_，不考慮蛋白質(zhì)加工的問題，如何產(chǎn)生與原來結(jié)構(gòu)相同的蛋白質(zhì)嗎？mRNA單鏈逆轉(zhuǎn)錄酶DNA單鏈DNA雙鏈酶cDNA成熟mRNA去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）前體mRNA相應(yīng)酶提示：把真核基因的cDNA導入到原核細胞中表達。（具體做法，如圖）利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物的實驗思路原核生物作為受體細胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。將目的基因?qū)胧荏w細胞基因表達載體受體細胞導入動物植物微生物將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的方法有何不同？將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：方法植物細胞：動物細胞：微生物細胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構(gòu)建也會有差別。（1）花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)）②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞1.目的基因?qū)胫参锛毎荏w細胞：受精卵花粉管通道法的過程：P811.將目的基因?qū)胫参锛毎诎`瘤農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠癭瘤等(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法P811.將目的基因?qū)胫参锛毎麨槭裁崔r(nóng)桿菌容易感染雙子葉植物？科學研究發(fā)現(xiàn)，當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞，這時農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移至受體細胞染色體的DNA上。這種酚類化合物主要在雙子葉植物細胞壁中合成，單子葉植物通常沒有(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法P811.將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌特點：·能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物?！まr(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。①載體：②受體細胞：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒主要是雙子葉植物和裸子植物隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法P811.將目的基因?qū)胫参锛毎?2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法構(gòu)建表達載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒表現(xiàn)出新性狀的植株導入植物細胞植物細胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質(zhì)粒T-DNA含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌③過程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Ti質(zhì)粒目的基因農(nóng)桿菌基因表達載體構(gòu)建轉(zhuǎn)入導入植物細胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細胞染色體DNA中表達新性狀該過程經(jīng)過____次拼接、____次導入①第一次拼接：_______________________________②第二次拼接：______________________________________________________________③第一次導入：__________________________________④第二次導入：__________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上

農(nóng)桿菌將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）拓展2、

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（采用最多）基因表達載體構(gòu)建Ti質(zhì)粒目的基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入導入植物細胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細胞染色體DNA中表達新性狀1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來會被整合到宿主細胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進入宿主細胞并整合到宿主細胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進入植物的一個體細胞中，但基因工程最終要的是一個轉(zhuǎn)基因植株，如何實現(xiàn)這一目標？

得到含有目的基因的植物細胞后進行植物組織培養(yǎng)三、將目的基因?qū)胧荏w細胞第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（采用最多）④

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：T-DNA目的基因構(gòu)建表達載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導入植物細胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）實驗具體操作①可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片（即外植體），與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生植株。受體細胞：體細胞②可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等受體細胞：受精卵第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞3.將目的基因?qū)雱游锛毎芫褬?gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物①

導入方法：②

受體細胞：③

過程：顯微注射法為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？①

體積大，易操作。②

全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因?qū)胛⑸锛毎?/p>

常用方法：②

受體細胞：Ca2+處理法常用原核細胞（大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛）目的：可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。優(yōu)點：生理結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)簡單，生長繁殖快，對環(huán)境因素敏感和容易進行遺傳物質(zhì)操作。Ca2+感受態(tài)細胞吸收第