DB1310T 345-2024平菇液體菌種制備技術(shù)規(guī)范

平菇液體菌種制備技術(shù)規(guī)范2024-06-28發(fā)布2024-07-28實(shí)施廊坊市市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出。本文件起草單位：廊坊市森淼春食用菌有限公司、廊坊師范學(xué)院、獻(xiàn)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、廊坊市自然資源與規(guī)劃局、廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局。本文件主要起草人：周志國、陳文杰、解春艷、王艷、侯桂森、任思竹、付強(qiáng)、閆訓(xùn)友、史振霞、張瑞青、杜偉娜、王素霞、喬麗秀、李春葉。1平菇液體菌種制備技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了平菇液體菌種的基本要求、生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)檔案等要求。本文件適用于平菇液體菌種的制備。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB150壓力容器GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB19172平菇菌種GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范GB/T4789.28食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T12728食用菌術(shù)語NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。液體菌種在生物發(fā)酵罐中通過深層培養(yǎng)(液體發(fā)酵)技術(shù)生產(chǎn)的液體形態(tài)的食用菌菌種。母種經(jīng)各種方法選育得到的具有結(jié)實(shí)性的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，以玻璃試管為培養(yǎng)容器和單位，也稱一級種、試管種。液體菌種菌齡菌種接入培養(yǎng)基開始計(jì)算的液體菌種培養(yǎng)時(shí)間。發(fā)酵罐空消對尚未加水投料的空發(fā)酵罐進(jìn)行高壓滅菌。發(fā)酵罐實(shí)消指對投料后的發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。2通氣量單位時(shí)間通入發(fā)酵罐中無菌空氣體積與發(fā)酵罐體積的比值。菌種活力菌種的生長、繁殖能力。4基本要求4.1人員要求工作人員應(yīng)該保持個(gè)人衛(wèi)生，進(jìn)液體菌種發(fā)酵車間須穿戴經(jīng)滅菌處理的工作服、口罩、鞋、帽。4.2場所要求生產(chǎn)場所符合NY/T528的環(huán)境衛(wèi)生要求，場地開闊、路面硬化、衛(wèi)生清潔。生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749要求。4.3廠房及設(shè)施要求廠房設(shè)計(jì)應(yīng)符合NY/T528要求。潔凈車間應(yīng)設(shè)有多功能實(shí)驗(yàn)室、菌種保藏室、無菌接種室、搖瓶室、發(fā)酵罐室，設(shè)計(jì)符合GB50073要求。4.4生產(chǎn)設(shè)備要求具有磅秤、量筒、量杯、天平、高壓蒸汽滅菌鍋、發(fā)酵罐、液體菌種接種器、超凈工作臺、調(diào)溫設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床或磁力攪拌器、冰箱、顯微鏡等及其它常規(guī)用具。壓力容器應(yīng)每年經(jīng)政府有關(guān)部門檢驗(yàn)合格，符合GB150要求。具有備用電源。5生產(chǎn)技術(shù)5.1工藝流程工藝流程步驟如圖1所示。發(fā)西擅空消發(fā)西擅空消實(shí)消成品液體菌種檢驗(yàn)檢測滅菌圖1工藝流程步驟35.2母種活化母種活化配方及操作流程應(yīng)符合NY/T528要求。活化后母種質(zhì)量應(yīng)符合GB19172要求。5.3搖瓶液體菌種生產(chǎn)使用無色或近無色專用玻璃三角瓶做搖瓶，使用硅膠塞或?qū)Ｓ梅饪谕笟饽みM(jìn)行封口。5.3.2培養(yǎng)基配方生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749要求，培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合NY/T528要求，玉米粉過30目篩。其中，培養(yǎng)基配方根據(jù)成分不同，分為配方1和配方2:——配方1:葡萄糖20g,蛋白胨5g,酵母膏2g,磷酸二氫鉀1g,硫酸鎂0.5g,維生素B?10——配方2:玉米粉10g,葡萄糖20g,酵母膏5g,牛肉膏2g,磷酸二氫鉀2g,硫酸鎂1g,維生素B?10mg,水1L,pH6.0～6.5。5.3.3培養(yǎng)基配制按液體培養(yǎng)基配方配制，玉米粉先用溫水?dāng)嚢杈鶆?，裝入搖瓶中，混合均勻，裝液量為搖瓶容量的2/5～3/5,并用專用封口透氣膜或硅膠塞封口。將分裝好的搖瓶放入滅菌鍋內(nèi)，采用高壓滅菌，滅菌溫度控制在121℃~122℃,維持25min~305.3.5接種滅菌后的搖瓶冷卻到室溫，無菌接種，接種7塊~8塊規(guī)格為(3～4)mm×(3~4)mm×(1～2)mm的母種塊于搖瓶培養(yǎng)基內(nèi)，菌種塊菌絲面朝上。5.3.6搖瓶菌種培養(yǎng)接種結(jié)束后封口，放入恒溫箱中23℃~25℃靜置培養(yǎng)24h,然后置于搖床上震蕩培養(yǎng)，搖床溫度控制在25℃±1℃,轉(zhuǎn)速180r/min,搖床培養(yǎng)5d~6d。培養(yǎng)全過程要求無光或弱光培養(yǎng)。5.3.7搖瓶菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液澄清透明，無雜菌；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)正常；菌絲球、菌絲片段密集，靜置1h后菌絲體體積不低于整個(gè)培養(yǎng)液體積的80%,均勻懸浮于液體培養(yǎng)基中不分層。5.4發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)5.4.1煮罐、空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長期放置、更換品種等情況出現(xiàn)其一時(shí)，應(yīng)煮罐和空消，煮罐操作步驟：在發(fā)酵罐中充滿水，通蒸汽加熱到100℃,煮沸1h,之后冷卻。注意冷卻過程中保持罐內(nèi)外及夾4層內(nèi)外空氣流通，以防罐體受壓損傷?？障僮鞑襟E：排凈發(fā)酵罐中的水，直接在發(fā)酵罐中通蒸汽，溫度126℃,維持40min~60min。5.4.2發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)基配方生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749要求，培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合NY/T528要求，玉米粉過30目篩。其中，培養(yǎng)基配方根據(jù)成分不同，分為配方1和配方2:——配方1:玉米粉8g,葡萄糖15g,酵母膏3g,牛肉膏2g,磷酸二氫鉀2g,硫酸鎂1g,維生素B?10mg,泡敵0.4g,水1L,pH6.0～6.5;——配方2:玉米粉10g,麥麩20g(煮汁),葡萄糖15g,蛋白胨3g,磷酸二氫鉀2g,硫酸鎂1g,泡敵0.4g,水1L,pH6.0～6.5。5.4.3投料和定容用溫水把玉米粉等原料攪拌均勻，混合后加入罐體，裝液量為罐體容量的60%～70%,加入0.4‰泡敵做為消泡劑，通入空氣鼓氣攪拌1min~2min,混合均勻，擰緊上料口蓋。5.4.4發(fā)酵罐實(shí)消發(fā)酵罐通入蒸汽加熱。待罐壓達(dá)到0.05MPa時(shí)，緩慢打開排氣閥降壓至0MPa排凈冷空氣，關(guān)閉排氣閥，通蒸汽升壓至0.11MPa,維持80min～90min。在位滅菌的空氣過濾器要通過閥門通蒸汽滅菌30min,其他與外界有流通的閥門開口如取樣口、排污口、接種口等均要通蒸汽30min滅菌。滅菌結(jié)束，關(guān)閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開空氣過濾器排水閥降壓至0MPa,夾層通入冷水降溫；同時(shí)緩慢打開發(fā)酵罐排氣閥降壓，待壓力接近0.01MPa時(shí)通過空氣過濾器向培養(yǎng)層內(nèi)通入無菌空氣，調(diào)整排氣閥，維持罐壓0.04MPa～0.05MPa,培養(yǎng)液溫度降至25℃時(shí)，關(guān)閉夾層進(jìn)水閥。接入搖瓶菌種，接種量為0.5‰~1‰。將搖瓶接種管和發(fā)酵罐外接種口用75%酒精消毒，用95%酒精的火焰圈套在接種口上，使發(fā)酵罐壓力為0.01MPa,并有氣體排出。點(diǎn)燃火焰圈，在火焰保護(hù)下將搖瓶菌種倒入發(fā)酵罐接種口，蓋上接種口蓋子，去掉火焰圈，擰緊接種口蓋。5.4.7發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)根據(jù)菌絲生長情況，適時(shí)調(diào)節(jié)進(jìn)氣按鈕，調(diào)節(jié)通氣量，通入適量無菌空氣，同時(shí)調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.03MPa～0.05MPa,培養(yǎng)溫度控制在23℃~25℃,培養(yǎng)6d~7d。5.4.8發(fā)酵罐液體菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)平菇發(fā)酵罐液體菌種感官見表1。5表1平菇發(fā)酵罐液體菌種感官要求培養(yǎng)液澄清透明，菌絲球、菌絲片段均勻懸浮于液體中，不分層，直徑小有平菇液體培養(yǎng)時(shí)特有的香氣，無酸、臭等異味，發(fā)酵罐排氣口氣顯微鏡下可見平菇菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，菌絲粗菌絲濕重(g/mL)菌種活力檢測無無5.4.9發(fā)酵罐液體菌種檢測發(fā)酵罐液體菌種檢測方法如下：——形態(tài)學(xué)觀察：主要是通過肉眼觀察菌球形態(tài)，包括菌液色澤、菌液形態(tài)、通過鼻嗅檢測菌液氣味，通過顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)?！猵H測定：通過pH計(jì)或pH試紙測定菌液酸堿度。pH小于5為不正常?！z濕重測定：檢測發(fā)酵水平，方法是稱取一定體積的培養(yǎng)液，經(jīng)10000r/min離心5min,稱重。——菌種活力檢測：將液體菌種接種到PDA平皿中，測量菌絲日平均生長速度?！咕鷻z驗(yàn)：按照無菌操作從取樣閥取少量疑有霉菌污染的培養(yǎng)液，接種于GB/T4789.28中規(guī)定的PDA培養(yǎng)基中，置于35℃~37℃恒溫培養(yǎng)48h,采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況和有無雜菌污染；若出現(xiàn)白色以外的雜色者，或有異味者為霉菌