生物技術(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù) 第2部分：細(xì)胞計(jì)數(shù)方法質(zhì)量控制的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析 征求意見稿

GB/TXXXXX—XXXX2生物技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)第2部分：細(xì)胞計(jì)數(shù)方法質(zhì)量控制的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析本文件提供了一種通過源自稀釋系列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析的質(zhì)量指標(biāo)來評估特定細(xì)胞制備物的細(xì)過程符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)（如細(xì)胞懸浮于溶本方法在細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的開發(fā)、優(yōu)化、驗(yàn)證、評估和/注：存在若干針對特定行業(yè)/應(yīng)用的國際和國家標(biāo)準(zhǔn)用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，在適用范圍內(nèi)，參考現(xiàn)ISO/WD20391-1，生物技術(shù)-細(xì)胞VIMJCGM200：2012，國3.1GB/TXXXXX—XXXX3注2：細(xì)胞濃度可指細(xì)胞總數(shù)或體積內(nèi)特定細(xì)胞子集的計(jì)數(shù)(如每細(xì)胞差異計(jì)數(shù)differentialc細(xì)胞亞群的細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過測量中確定的至少一個不同的細(xì)胞屬性將其與其他細(xì)胞亞群區(qū)分注1：由差異細(xì)胞計(jì)數(shù)得出的濃度可以用絕對濃度表示，也可以用相對于總細(xì)胞數(shù)或另一個預(yù)定義注2：對于細(xì)胞懸液，稀釋系列是一組細(xì)胞濃度增加或減少的GB/TXXXXX—XXXX4注1：為參與者分配實(shí)驗(yàn)條件的計(jì)劃以及與該計(jì)劃相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析。通常，這包括對自變量、因變條目1注：通常獨(dú)立稀釋系列是直接從普通原液中以預(yù)先指定的(或目標(biāo))稀釋分注2：操作人員偏差特指由人為操作人員經(jīng)驗(yàn)引起的誤差。[來源：VIMJCGM2002：可使用特定分析方法以適當(dāng)?shù)木芏群蜏?zhǔn)確度定量測定樣品中的最低在給定范圍內(nèi)，分析方法獲得與樣品中分析物的濃度(量)成正比的測試結(jié)果的能力注1：在細(xì)胞計(jì)數(shù)中，分析物濃度是指樣品中細(xì)胞(總細(xì)胞或注2：當(dāng)一組測量值在給定輸入的范圍內(nèi)呈線性時(shí)(同時(shí)所有其他輸入和測量條件保持值的期望值可以表示為恒定偏置項(xiàng)和輸入?yún)?shù)乘以固定常數(shù)的測定稀釋分?jǐn)?shù)measureddilutionfraGB/TXXXXX—XXXX5測量過程measurementpr測量精度measurementprec在規(guī)定條件下對相同或類似物體進(jìn)行重復(fù)測量而獲得的指示或測量量值之間的一致性注1：在規(guī)定的測量條件下，測量精度通常用不精確的測量值，如標(biāo)準(zhǔn)差、方差或變異系數(shù)(CV)來注2：“規(guī)定條件”可以是，例如，測量的重復(fù)性條件，測量的中間精度條件，或測量的再現(xiàn)性條無論范圍如何，分析程序獲得與樣品中的分析物濃度（量）直接成比例的測試結(jié)測量所采取的輸入?yún)?shù)值之比保持恒定（同時(shí)保持所有其他輸入和測量條件注3：當(dāng)一組測量值在給定的輸入范圍內(nèi)呈現(xiàn)比例其中Y，測量值的期望值表示為輸入?yún)?shù)(X)乘以固定常數(shù)(c)，將測量值與輸入?yún)?shù)直接聯(lián)系起來的常數(shù)乘對于稀釋系列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的比例關(guān)系偏離的度注1：p值的獲取方式如下：在原假設(shè)成立的假設(shè)下，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的分布被確定，稱為零分布。p值注2：根據(jù)所考慮的假設(shè)集的不同，極值可以有不同的含義。當(dāng)沒有指定備選假設(shè)時(shí)，“更極端”比(即在零分布下分配給給定檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的密度除以在備用分布下分配給該檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量GB/TXXXXX—XXXX6注3：產(chǎn)生低于預(yù)選閾值(通常為0.05)的p值的數(shù)據(jù)通常被解釋為提供了足夠的證據(jù)來拒絕零假設(shè)(如果指定，則支持備選假設(shè))。雖然產(chǎn)生的p值大于預(yù)選閾值的數(shù)據(jù)不能提供足夠的證據(jù)證明零假一種現(xiàn)象、物體或物質(zhì)的性質(zhì)，該性質(zhì)有一個大小，可以用數(shù)字分析方法已被證明具有適當(dāng)?shù)木芏?、?zhǔn)確度和線性水平參考測量程序referencemeasurementpr測量的重復(fù)性條件repeatabilityconditionofmeasur一組條件中的測量條件，包括相同的測量程序、相同的操作人員、相同的測量系統(tǒng)、相同的操作條件和相同的位置，并在短時(shí)間內(nèi)對相同或類似的物體進(jìn)注1：測量條件僅是相對于一組指定的重復(fù)性條件而言的重復(fù)注1：重復(fù)性也可以被認(rèn)為是在相同的測量條件下進(jìn)行的同一測量的連續(xù)測量結(jié)果之間的一致性的[來源：VIMJCGM200：2012，2.GB/TXXXXX—XXXX7從系統(tǒng)中取出的一個或多個部分，旨在提供注1：通常樣本用作對系統(tǒng)或其生產(chǎn)進(jìn)行決注2：例如，從較大體積的細(xì)胞懸液中提取較小體積或等比的細(xì)胞懸[來源：VIMJCGM200：2012，4.13，修一種物質(zhì)在溶液中的逐步稀釋，其中濃度的降低是累積的，隨著每注1：在連續(xù)稀釋系列中，除第一次稀釋外的所有稀釋都依賴于足夠高的濃度和足夠穩(wěn)定（隨時(shí)間推移）的細(xì)胞懸液，以便在在重復(fù)測量中保持恒定或以可預(yù)測的方式變化的測量誤差的組成注1：系統(tǒng)測量誤差的參考量值是真實(shí)量值，或測量不確定度可忽略的測量標(biāo)準(zhǔn)的測量量值，或常注2：系統(tǒng)測量誤差及其原因可以是已知的，也可以是未知的。修正可用于補(bǔ)償已知的系統(tǒng)測量誤注1：一般來說，測試樣品具有其制備樣品的GB/TXXXXX—XXXX8注1：在描述測量的誤差法中，真實(shí)的量值被認(rèn)為是唯一的，并且在實(shí)踐中是不可知的。不確定性,由于數(shù)量定義中固有的不完整的細(xì)節(jié)量，不存在單一的真量值，而是一組與定義一致的真量值。注3：當(dāng)與被測量量相關(guān)的定義不確定性被認(rèn)為相對于其他測量不確定性成為可以忽略的因素時(shí)，被測量量可以被視為具有"基本上唯一"的真實(shí)數(shù)量值。這是GUM（GuidetotheExpressionofUncertaintyinMeasurement，測量不確定度表達(dá)指南）及相關(guān)文件所采用的方法，其中認(rèn)為"真通過提供客觀證據(jù)的方式，確認(rèn)特定預(yù)期使用或應(yīng)用的要求已經(jīng)3.2縮略語列表truecountitureDFcidealE(observedcounts)iΒPIEesmoothed處理后的細(xì)胞計(jì)數(shù)與比例模型擬合之間的殘差平滑yijkIJKGB/TXXXXX—XXXX9InikijdfidfijDFDFmeasuredYdfi分?jǐn)?shù)(dfi)Yij對于代表性測試樣本j的dfi，對Kij次重復(fù)觀cvijkii次重復(fù)觀察結(jié)果的變異系數(shù)%CVdfi在目標(biāo)稀釋系數(shù)di下，對于一組ni個代表性λproportionalij比例模型擬合Yij與dfijβ1R2對于一組ni個獨(dú)立的重復(fù)代表性測試樣本，對代表性測試樣本j的yij取平均值λproportionalDFKλppspspsispiiiesmoothedi在比例性分析中使用目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)時(shí)的平滑殘差esmoothedij測量稀釋分?jǐn)?shù)時(shí)的平滑殘差用于比例性分析(每性概念可用作內(nèi)部參考，而與比例偏離可以作為評估準(zhǔn)確度的直接評價(jià)的替代方法[2]。具體而言，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析，可以評估描述與比例偏離和變異系數(shù)(CV)相關(guān)的質(zhì)量指標(biāo)，以評估細(xì)胞計(jì)理想情況下，可以使用已知“真實(shí)”值的參考方法和/或參考材料1994和ISO5725-2：1GB/TXXXXX—XXXXTurecounti=cideal*tureDFi[1]Turecounti為樣本i的理論真計(jì)數(shù)；cideal為一個未知的比例常數(shù)，等于未稀釋樣品的理論真計(jì)數(shù)；通過嚴(yán)格控制稀釋分?jǐn)?shù)，理論tureDtureDFi=DFi[2]在沒有進(jìn)行校準(zhǔn)的情況下，但其他方面是理想的測量過程將展示預(yù)期觀察計(jì)數(shù)的期望值E(observedcountsi)與稀釋比例之間的比例關(guān)系。換句話說，在沒有系統(tǒng)性測量誤差的情況下，這種測量過程將滿E(observedcountsi)=β*D將Eq.1和Eq.3結(jié)合起來，可以通過一個常數(shù)直接聯(lián)系真實(shí)計(jì)數(shù)和E(observedturecounti=cideal*E(observeβ如果β未知，預(yù)期的比例關(guān)系（Eq.3）與測我們可以判斷測量過程的質(zhì)量，并且可以檢測出任何偏離比例性注：與稀釋成比例的測量誤差不會導(dǎo)致比例的顯著變化，因此不會在比例偏差分析中檢測到。4.2偏離比例通過匯總處理后的細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)與比例模型擬合的偏差來評估偏離比例性的情況。(圖1GB/TXXXXX—XXXX釋分?jǐn)?shù)有3個測試樣品。點(diǎn)表示重復(fù)觀察的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)；線表示與數(shù)據(jù)擬合的比例模型；而虛線表示細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)與比例擬合之間的偏差或殘差殘差(e)可能是測量過程中系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差或其組合的結(jié)果。因此，殘差函數(shù)對偏差和精度的比例指數(shù)將基于對比例模型擬合的平滑殘差(esmoothed)的分析來計(jì)算(參見第6.4節(jié))。注：通過假設(shè)檢驗(yàn)(產(chǎn)生P值)評估比例偏差，其中零假設(shè)假定預(yù)期計(jì)數(shù)的行為與稀釋分?jǐn)?shù)成正比，替代假設(shè)是更靈活的(例如，線性或二次)模型P值評估，不推薦，因?yàn)楦唠S機(jī)測量誤差會降低檢測比例殘差(e)可能是測量過程中系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差或其組合的結(jié)果。因此，殘差函數(shù)對偏差和精度的比例指數(shù)將基于對比例模型擬合的平滑殘差(esmoothed)的分析來計(jì)算(參見第6.4節(jié))。成比例，而備擇假設(shè)是更靈活的（例如線性或二次）模型，這種p值評估方法不被推薦，因?yàn)楦唠S機(jī)測量誤差會降低檢測到偏離比例性的統(tǒng)計(jì)顯著本文檔中描述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析方法可用于評估測試樣品處于懸液形式的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程這種方法可以應(yīng)用于總計(jì)數(shù)、差異計(jì)數(shù)、直接計(jì)數(shù)和間接計(jì)數(shù)的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過注：如果在計(jì)數(shù)之前需要進(jìn)行重要的細(xì)胞處理，例如在細(xì)胞聚集體中生長的細(xì)胞需在計(jì)數(shù)之前進(jìn)注：對于本文檔的目的，如果細(xì)胞嵌入到基質(zhì)中或粘附在表面上，將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為懸液的過程不被GB/TXXXXX—XXXX實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)材料應(yīng)為懸浮細(xì)胞。細(xì)胞可能處于反映細(xì)胞行為的條件下(即單個細(xì)胞、細(xì)胞聚集樣品制備程序應(yīng)避免以改變細(xì)胞計(jì)數(shù)能力的方式破壞細(xì)胞，或以引入/減少可能干擾或人為改善細(xì)注1：參考文獻(xiàn)[4-7]可對特定細(xì)胞類型和細(xì)胞樣品的樣品制備程序提供進(jìn)一步的性質(zhì)的穩(wěn)定性。更多信息請參見ISO20391-1：2018。注2：含有活細(xì)胞的樣品是動態(tài)的，因此在可能影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的特性方面可能不穩(wěn)定。諸如細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和細(xì)胞-物質(zhì)相互作用等相互作用可引應(yīng)使用與評估中相同的測量過程對細(xì)胞原液的細(xì)胞濃度進(jìn)定質(zhì)量指標(biāo)。因此，細(xì)胞原液和有代表性的測試樣品應(yīng)與用于測量過程的測廣義稀釋分?jǐn)?shù)(DF)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖2所示。有關(guān)DF實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的更具體示例，請參見附錄C設(shè)yijk表示在普通細(xì)胞液中第i個目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)的第j個重復(fù)代表性測試樣品的第k次重復(fù)觀察中觀察(0~1之間)；設(shè)c表示為目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)i制備的具有代表性的重復(fù)測試樣品的個數(shù)i；令kij稀釋分?jǐn)?shù)制備的第jth個重復(fù)ith代表性測試樣品的重應(yīng)生成一組代表性測試樣品，這些樣品基于一組唯一的目標(biāo)稀釋樣品中的細(xì)胞濃度落在細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程的預(yù)期使用濃度范圍內(nèi)。一般來說，應(yīng)生成至少四個唯一的GB/TXXXXX—XXXX應(yīng)生成重復(fù)的代表性測試樣品。一般來說，應(yīng)在每個dfi（即ni≥3）處生成至少三個重復(fù)的代表性選擇適當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)(如df的數(shù)量，重復(fù)代表性測試樣品的數(shù)量，測量的次數(shù))應(yīng)根據(jù)所述的目的，并考慮樣品的可用性和代表性測試樣品在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。功率分析(或功率分析)(即研究在替代假設(shè)為真時(shí)檢測替代假設(shè)的能力)可以促進(jìn)適當(dāng)設(shè)計(jì)的選擇[8]。對測量不確定度的分析也有助于選擇合適的如果樣品可用性和/或穩(wěn)定性是一個限制因素，則實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能地首先保持稀釋分?jǐn)?shù)的圖2：示意圖描述了一個稀釋分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示例。從一個單一的原始溶液開始，通過獨(dú)立的稀釋制備了一組I個目釋分?jǐn)?shù)（df1，df2，...，todfI）。每個代表性測試樣品（ni=3）都需要制備三個復(fù)制的試樣，并對每個代表性測試樣應(yīng)采取預(yù)防措施，以確保通過可重復(fù)的過程產(chǎn)生稀釋GB/TXXXXX—XXXX注1：減少稀釋操作的次數(shù)可以最大限度地減少由于稀釋過程引起的可變性。稀釋過程應(yīng)避免產(chǎn)生理想情況下，稀釋分?jǐn)?shù)應(yīng)當(dāng)是已知的，且等于dfi。然而在實(shí)際操作中，真實(shí)的稀釋分?jǐn)?shù)可能會以響，包括移液誤差、細(xì)胞懸液的不均勻性、細(xì)胞流失到容器/移液管尖端、細(xì)胞隨時(shí)間的不穩(wěn)注2：移液器使用的進(jìn)一步通用指南可從文獻(xiàn)中獲得，參見參考文獻(xiàn)[9]和ISO8655-1：2002、ISO注3：在本文件中，移液誤差特指在制備代表性測試樣品時(shí)對移液懸浮液體積的不準(zhǔn)確假設(shè)所引起整性貢獻(xiàn)的接受標(biāo)準(zhǔn)，則在生成代表性測試樣品時(shí)，可以通過獲得每個獨(dú)立代表性測試樣品的測量DF來解釋移液誤差對稀釋完整性的貢獻(xiàn)(見附件A.2.)。在這種情況下，測量的稀釋分?jǐn)?shù)的集合，記為改進(jìn)的統(tǒng)計(jì)分析方法。(見附件B、附件C)。代表性的測試樣品應(yīng)標(biāo)注足夠的信息，以確保對原液和測試樣品的稀釋分?jǐn)?shù)的可追溯性。如果細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程涉及手動獲取細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法(例如，使用血細(xì)胞計(jì)進(jìn)行手動細(xì)胞計(jì)數(shù))和/保操作人員在測量和/或分析過程中對樣品稀釋和濃5.4測試樣品的測量應(yīng)根據(jù)為評估中的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程建立的程序，從每個代表性測試樣品中制備測量樣品。參見在制備每個測量樣品之前，應(yīng)將有代表性的測試樣品充分混測量應(yīng)按照為所評價(jià)的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程建立的程序進(jìn)行。細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程包括樣品制備(如染校正、門控、圖像分析參數(shù)設(shè)置)。參見ISO20391-1：2018了解更GB/TXXXXX—XXXX一組代表性測試樣品的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)（Ydfi），其目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)為dfi，可以用以下公式表示，其Y′ij.表示對于第j個代表性測試樣品的一組Kij次重復(fù)觀察的平均值，其目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)為dfi，公式為6.2測量精度對于代表性測試樣品j的一組重復(fù)觀察kij，在目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)為dfi的情況下，變異系數(shù)（CV）的計(jì)Yij表示從對樣本j的kii次測量中觀察到的平均細(xì)胞濃度，其計(jì)算公式為Eq.6GB/TXXXXX—XXXX一組代表性測試樣品的平均變異系數(shù)百分比（%cvdfi），其目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)為dfi，可以用以下公式表示，其中代表性測試樣品的數(shù)量為ni：將yij與dfii擬合成比例模型，可以使用以下公式：如果稀釋完整性經(jīng)過預(yù)評估，并且符合用戶定義的稀釋完整性規(guī)格（請參見附），數(shù)i下測得的實(shí)際稀釋分?jǐn)?shù)（dfij）。應(yīng)選擇一個適當(dāng)?shù)募僭O(shè)來對比例模型擬合的均值-方差關(guān)系進(jìn)行觀察到的計(jì)數(shù)與稀釋分?jǐn)?shù)的比例性應(yīng)使用加權(quán)最小二乘建模方法與假設(shè)的均值-方差關(guān)系進(jìn)行評估。對于每個樣本，比例模型預(yù)測的細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)λpijroportional=β1*dfij[9]6.4決定系數(shù)性測試樣品j對于一組DF目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)下的yij.的均值，對于一比例指數(shù)(PI)應(yīng)基于對比例模型擬合的平滑殘差(esmoothed)的GB/TXXXXX—XXXX注1：基于非平滑殘差的評價(jià)可作為單個細(xì)胞計(jì)數(shù)測量值與其各自理想值的接近程度的適當(dāng)指標(biāo)，注2：PI是與所討論的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程有關(guān)的特定值，包括細(xì)胞制備、測量系統(tǒng)和所選的設(shè)置和注3：PI的計(jì)算嚴(yán)重依賴于精確的稀釋分?jǐn)?shù)(假設(shè)見式2)。稀釋分?jǐn)?shù)中未考慮的隨機(jī)或系統(tǒng)誤差將6.5.1平滑殘差的計(jì)算（esmoothed）當(dāng)滿足用戶定義的稀釋完整性標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，在具有目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)dfi的一組ni個代表性測試樣品中，使用細(xì)胞數(shù)量的平均值（ydfi）來計(jì)算每個dfi下的eismoothed，公式如下：dfiλproportional是在dfi處的估計(jì)細(xì)胞數(shù)量，使用方程式9中的β1進(jìn)行計(jì)算，公式如下：dfi獲取測量的稀釋分?jǐn)?shù)dfij。然后，根據(jù)附錄B，可使用測量的稀釋分?jǐn)?shù)dfij來計(jì)算每個代表性測試樣品的平滑殘差(eismoothed)。用戶應(yīng)根據(jù)平滑殘差(eismoothed或eijsmoothed)計(jì)算PI。用戶應(yīng)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)測量的預(yù)期用途選擇計(jì)算PI的R22GB/TXXXXX—XXXX按百分比而不是絕對比例進(jìn)行分配。這種方法將在稀釋分?jǐn)?shù)中均勻注：作為一個例子，可以使用每個平滑殘差的絕對值乘以比例模型相應(yīng)預(yù)測計(jì)數(shù)的總和（即，縮在接近未稀釋樣本的行為可能會主導(dǎo)PI的特征描述。此外，與“殘差的平方值”相比，使用“殘差的絕對值”可以減少離群值的影響，并且在匯總統(tǒng)計(jì)量中同等地權(quán)衡每個殘差片段（即，如果一個縮放殘差是6.7資料解釋樣品處理、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理/校正過程中使用的方法。質(zhì)量指標(biāo)是針對測量過程和所研究的細(xì)胞樣p值或置信區(qū)間可用于比較不同細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程之間的CV。觀測數(shù)據(jù)中更大比例的變化。R2的評估依賴于數(shù)據(jù)的隨機(jī)變異性。因此，R2值不的來源是由隨機(jī)變異性(數(shù)據(jù)不精確)還是系統(tǒng)歧化引起的。對原始?xì)埐?即未平滑)的R2的評估基于單個測量值與其各自理想值的接近程度來表征性能，而不是基于偏離比例性的系統(tǒng)誤差。注：R2>0.95是有意義要求的一般解釋與本分析無關(guān)。GB/TXXXXX—XXXX離比例的情況都表明存在隨機(jī)和/或系統(tǒng)性的測量誤差。例如，細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程的靈敏度差或使用超出定量限制的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程可能導(dǎo)致測量誤差，從而滑殘差的R2的PI（即PIR2SR）的情況下，更接近0的值表示與比例關(guān)系的偏差更大，測量質(zhì)量較差。在使用相同稀釋系列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(包括名義上相似的原液細(xì)胞濃度)和相同統(tǒng)計(jì)分析方法的可以比較PI值來評估細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程之間、細(xì)胞類型之間和隨時(shí)間的比例偏差和置信水平，并應(yīng)報(bào)告非參數(shù)自舉模擬的條件(例如自舉迭代的次數(shù)和置注1：非參數(shù)自舉分析適用于仿真的前提條件與執(zhí)行的分析相一致注2：從重復(fù)PI測量中確定的大量PI值可用于識別根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)測量的預(yù)期用途，可以報(bào)告細(xì)胞計(jì)數(shù)的其他表達(dá)(例如細(xì)胞/cm2或細(xì)胞/mg微載體)。a)Y每個dfi的Ydfi(見6.1)b)每個dfi的%CVdfi(見6.2)7.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析方法文件報(bào)告應(yīng)包括關(guān)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析的信息，包括以下內(nèi)容，以使審查數(shù)據(jù)但未參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和/1.唯一目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)集(DF={df2.重復(fù)代表性測試樣品個數(shù)(ni)3.重復(fù)觀察數(shù)(kij)GB/TXXXXX—XXXX的稀釋分?jǐn)?shù)，如附件A.2所述。如果進(jìn)行移液誤差對稀釋完整性貢獻(xiàn)的預(yù)評價(jià)，則應(yīng)報(bào)告移液誤差對稀c)比例模型擬合中使用的假設(shè)均值-方差關(guān)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析的附加報(bào)告要素還可能包括以c)每次細(xì)胞計(jì)數(shù)測量的時(shí)間和/或樣品制備和d)統(tǒng)計(jì)分析程序-附加指標(biāo)，附加指標(biāo)的定義，建模選擇的理由，引導(dǎo)模擬參數(shù)。7.3細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程的附加報(bào)告要素細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程的附加報(bào)告要素可能包括以下項(xiàng)a)細(xì)胞類型，代數(shù)或數(shù)量倍增b)試劑-名稱，來源，批號，原產(chǎn)國，動物或人類來源c)測量過程-包括儀器、儀器設(shè)置、評價(jià)細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程質(zhì)量和相關(guān)報(bào)告要素的用例示例見附件D和附GB/TXXXXX—XXXX本附錄的這一部分提供了針對本標(biāo)準(zhǔn)具體評估稀釋A.2使用校準(zhǔn)刻度預(yù)評估移液誤差對稀釋完整性貢獻(xiàn)的示例程序，以在移液時(shí)獲得準(zhǔn)確的體積估計(jì)為預(yù)評估稀釋完整性概述的示例程序可以用作提高稀釋完整性的工具，以便為執(zhí)行細(xì)胞計(jì)數(shù)第2部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇的最終移液程序符合用戶定義的規(guī)范。此外，預(yù)評估稀釋完整性的程序大綱也可以用A.2.1按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中將用于生成獨(dú)立的代表性測試樣本的稀釋方案（對于計(jì)算PI，包括重復(fù)）來進(jìn)在每個目標(biāo)DF（dfi）下，請按照相應(yīng)的稀釋方案進(jìn)行稀釋，并生成相應(yīng)的測試樣本。。稀釋應(yīng)由相同的操作人員進(jìn)行，使用相同的移液器/類型的移液頭，并使用將在評估PI時(shí)使用的類i.一種類似于用于評估PI的細(xì)不建議用水來稀釋樣品，因?yàn)榕c水相關(guān)的移液誤差通常低于與移液細(xì)胞懸液相關(guān)的在稀釋過程中，測量將進(jìn)行移液的懸浮液的質(zhì)量，即m1ij和m2ij，其中m1ij是待稀釋樣本的質(zhì)量，m2ij是移液生成目標(biāo)稀釋因子為dfi的測試樣本時(shí)移液的稀釋溶液的質(zhì)量。例如，靈敏度為0.0001g的校準(zhǔn)刻度可用于精確測量低至0.01mL的樣品體積的質(zhì)量測量(參見ISO假設(shè)待稀釋樣品的密度和稀釋介質(zhì)近似相等，則每個代表性測試樣品的預(yù)估DF(dfijpre-evaluated)在計(jì)算dfijpre-evaluated時(shí)應(yīng)考慮每個溶液的密度。A.2.2計(jì)算預(yù)先評估的稀釋完整性繪制dfijpre-evaluatedvsdfi擬合一條被約束在原點(diǎn)(0，0)處通過的直線，即比例模型擬合：GB/TXXXXX—XXXXβpipetting是一個常數(shù)；Ei表示dfijpre-evaluated與比例趨勢的偏離程度。在理想情況下βpipetting將等于1計(jì)算用于稀釋完整性的移液誤差貢獻(xiàn)的決定系數(shù)(Rdilution2)。如果Rdilution2大于或等于預(yù)先指定的用戶定義標(biāo)準(zhǔn)（基于預(yù)期用途），則認(rèn)為稀釋完整性足夠，可一般而言，對于稀釋完整性可接受的移液誤差貢獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少為Rdilution2≥0.98。劑體積eβpipettingRdilution212311111211361626A.3在PI評估過程中獲得測量的DF的示例程序溶液的密度在名義上相等時(shí)，溶液的質(zhì)量之比提供了測量的稀釋分?jǐn)?shù)(dfij)。GB/TXXXXX—XXXXA.3.1按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中描述的稀釋方案，在每個目標(biāo)DF(dfi)處生成獨(dú)立的代表性i測試樣品，用于計(jì)在稀釋過程中獲得每個獨(dú)立的代表性測試樣本j，在目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)i處測量被移液的細(xì)胞懸液(m1ij)的質(zhì)量和被移液的稀釋液(m2ij)的例如，靈敏度至少為0.0001g的校準(zhǔn)刻度可用于精確測量低至0.01mL假設(shè)細(xì)胞懸液和稀釋介質(zhì)的密度近似相等，則每個代表性測試樣品(dfij)的實(shí)測DF可計(jì)算為：dfij時(shí)應(yīng)考慮每種溶液的各自密度表A.2：每個代表性測試樣本的數(shù)據(jù)收集和測量DF評估示例dfij123111112113123GB/TXXXXX—XXXXA.4基于獲得稀釋分?jǐn)?shù)的方法計(jì)算平滑殘差的不同方法的圖形表示。GB/TXXXXX—XXXX當(dāng)獲得一組測量稀釋分?jǐn)?shù)（DFmeasured）時(shí)，計(jì)算平在細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程的評估中獲得測量稀釋分?jǐn)?shù)（dfij）時(shí)，根據(jù)每個代表性測試樣品的建模細(xì)胞計(jì)數(shù)(λdfijflexible），應(yīng)按照本附錄中所述的方法計(jì)算esmoothed。為了計(jì)算當(dāng)獲得測量的稀釋因子（esmoothedij）時(shí)的平滑殘差，通過對yij與dfij之間的關(guān)系進(jìn)行加權(quán)最小二乘模型建模，根據(jù)柔性模型約束估計(jì)每個代表性測試樣本的建模細(xì)胞數(shù)量值(λdfijflexible)。例如，在具有3個目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)(I=3)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，采用準(zhǔn)泊松分布假設(shè)的二eijsmoothedij為具有代表性的測試樣本j，目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)i計(jì)算λdfijproportional為df處ii估計(jì)的細(xì)胞數(shù)量，使用Eq.9中的β1計(jì)算為：GB/TXXXXX—XXXX按比例平滑殘差絕對值之和計(jì)算的PI值(PIAbsSSR)當(dāng)使用Eq.12計(jì)算eismoothed時(shí)，PIAbsSSR表達(dá)式如下：λdfiproportional是根據(jù)Eq.13估計(jì)的在dfi處的細(xì)胞數(shù)量當(dāng)使用eijsmoothed（Eq.B2）時(shí)λdfiproportional是在dfij處估計(jì)的細(xì)胞數(shù)量，其表達(dá)式由Eq.B3給出當(dāng)使用eismoothed（Eq.12）時(shí)，PIR2SR的計(jì)算公式為：Y…是在一組給定的目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)中，每個dfi處細(xì)當(dāng)使用eijsmoothed（Eq.11）時(shí)，PIR2SR的計(jì)算公式為：λdfijflexible是由Eq.B1給出的，對于每個重復(fù)的代表性測試樣本j，在目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)dfi處λflexible是在所有重復(fù)的代表性測試樣本以及所有目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)中，靈活建模的細(xì)胞數(shù)量值(λdfiflexible）的平均值。GB/TXXXXX—XXXXPIR2SR通常范圍在0到1之間。PIR2SR越接近1，表示測量過程具有更高的比例關(guān)系?；谄交瑲埐钇椒胶偷腜I(PISqSR)：基于絕對平滑殘差之和的PI(PIAbsSR)：基于縮放后的平滑殘差平方和的PI(PISqSSR)：在這些情況下，接近于0的PI描述了具有更大比例性的測GB/TXXXXX—XXXX細(xì)胞計(jì)數(shù)第2部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析的最簡單案例是對單細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的質(zhì)量評價(jià)。在這個用例中，評估方法的標(biāo)準(zhǔn)中描述的參數(shù)(%CV，R2用方法2對A型細(xì)胞對每個重復(fù)代表性測試樣本進(jìn)行三次總細(xì)胞計(jì)數(shù)測量。隨機(jī)分配樣本標(biāo)簽，并按其制備獨(dú)立重復(fù)代表性測試樣品時(shí)，獲得測量的稀釋分?jǐn)?shù)。然后將測量的稀釋分?jǐn)?shù)用于分析PI，如附件A.2和附件B所述?？偧?xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用準(zhǔn)泊松假設(shè)（均值與方差成比例）對均值-方差關(guān)系進(jìn)行建模。使用非參數(shù)自表D1：用例1的原始數(shù)據(jù)表可在網(wǎng)上找到：(有GB/TXXXXX—XXXX圖D.2：比例模型使用測量的稀釋分?jǐn)?shù)擬合稀釋系列數(shù)據(jù)。上行：比例模ijsmoothed)每個dfi.(7.1a)的平均細(xì)胞濃度（Ydfi）可在表D.1Ydfi對于每個目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)dfi，濃度以細(xì)胞數(shù)/mL表示（7.1a）計(jì)數(shù)法目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)(dfi)Ydfi(細(xì)胞/mL)Ydfi標(biāo)準(zhǔn)偏差(細(xì)方法20.11083336300方法20.332998317536方法20.550470516297方法20.775746230249方法20.99495717874每個dfi的平均百分比變異系數(shù)（%cVdfi）可以在表格D2中找到（7.1b）。表格D.2：每個dfi的%CVdfi（7.1b）。計(jì)數(shù)法目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)(dfi)i%CVdfi標(biāo)準(zhǔn)差方法20.15.6%4.6%方法20.37.7%5.2%方法20.54.9%3.9%方法20.73.8%1.0%方法20.93.9%0.5%GB/TXXXXX—XXXX表D.3：R2為比例模型擬合(7.1c)R2D.4.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析方法文檔(7.2）：ii.獨(dú)特目標(biāo)稀釋比集合（）：iii.每個dfi上的重復(fù)測試樣本（j）數(shù)量（ni表D5）iv.每個dfi上的每個重復(fù)測試樣本（j）的重復(fù)觀測（k）數(shù)量（Kij表D6）nin13n23n33n43n53表D.6：每個重復(fù)測試樣本(j)在每個Kij上的重復(fù)觀察數(shù)(k)KijK113GB/TXXXXX—XXXXK123K133K213K223K233K313K323K333K413K423K433K513K523K533評價(jià)移液誤差對稀釋完整性貢獻(xiàn)的方法(7i.對于每個生成的測試樣本，根據(jù)附錄A.2獲得了測量的iii.根據(jù)附錄B和附錄C.1計(jì)算了基于dfij和eijsmoothed的P12312123123123在比例模型擬合(7.2c)中用于建模均方差關(guān)系i.均值-方差關(guān)系的假設(shè)：方差與均值成正比。比例模型擬合方程(7.2dGB/TXXXXX—XXXXi.(λdfiproportional=β1*dfij)，系數(shù)如表D8所示表D.8：比例模型擬合方程(λdfiproportional=β1*dfij)β1CI(細(xì)胞/mL)A型細(xì)胞PI的計(jì)算方法(7.2e)：i.計(jì)算PI的主要方法：將經(jīng)過縮放的平滑殘差的絕對值求和(PIAbsSSR)。ii．平滑方法：基于測量的稀釋系數(shù)進(jìn)行平滑處理(eijsmoothed)。D.4.37.2和7.3中關(guān)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程的iii.儲備溶液濃度（細(xì)胞/mL約9237i.稀釋劑：含有10%FBPI的方法PI(對于方法2，細(xì)胞類型A)下限95%CI(基于非參數(shù)自舉分析)上限95%CI(基于非參數(shù)自舉分析)#IR2sR0.99930.99770.9998PIAbsSSR1.59210.77223.1779#IsqssR0.01160.00410.0419GB/TXXXXX—XXXX需要進(jìn)行調(diào)查。R2和%cVdfi的解釋類似。GB/TXXXXX—XXXX細(xì)胞懸液通過四個不同的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程進(jìn)行三重評估。在這種使用情況下，比較標(biāo)準(zhǔn)描述的參數(shù)在這個案例研究中，使用計(jì)算模擬了四種細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程，并建立了模型來展示比例/非比例響應(yīng)以及精確/非精確響應(yīng)?？偣材M了5個目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)，每個稀釋分?jǐn)?shù)有3個獨(dú)立重復(fù)的代表性測試樣總細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)使用準(zhǔn)泊松假設(shè)(均值與方差成正比)對均值-方差關(guān)系進(jìn)行建模。使用200次迭代的表E.1：用例2的原始數(shù)據(jù)表可以在網(wǎng)上找到：(GB/TXXXXX—XXXX按照附錄A.1（表E1），進(jìn)行了移液誤差對稀釋完整性的預(yù)為R2dilution≥0.980。dfiPre-evaluatedDFdfpre-evaluatedij0.10.10040.10.09890.10.10180.30.30360.30.310.30.30420.50.48740.50.49790.50.51930.70.72530.70.7080.70.70020.90.90690.90.89920.90.9006生成了一個圖表，展示了dfijpre-evaluated之間的關(guān)系，并使用通過原點(diǎn)（0，0）的線條（即比例模型）：βpipetting=1.008R2dilution=0.9991GB/TXXXXX—XXXX圖E.2：以比例模型擬合的方式繪制的dfpre-evaluated相對于目標(biāo)稀釋比例(dfi)的圖表，用于評據(jù)進(jìn)行比例模型擬合（單位：細(xì)胞/mL）。中間行：比例模型擬合的原始?xì)埐睿▎挝唬杭?xì)胞/mL）。底GB/TXXXXX—XXXX每個dfi對應(yīng)的平均細(xì)胞濃度(ydfi)。(7.1a)：圖E4：每種計(jì)數(shù)方法中，在每個目標(biāo)稀釋比例(dfi)下，跨多個重復(fù)代表性測試樣本的平均細(xì)胞濃度(ydfi)。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。細(xì)胞濃度的單位為細(xì)胞/mL。表E.2：每種方法在每個目標(biāo)稀釋比例dfi下的ydfi。濃度以細(xì)胞/mL為單位。(dfi)YdfiYdfi標(biāo)準(zhǔn)差GB/TXXXXX—XXXX每個dfi下的平均百分比CV（%CVdfi），(7.(%CVdfi)。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。表E3：每個dfi下的CVdfi(dfi)24.5%49.0%24.7%9.8%GB/TXXXXX—XXXX圖E6：使用非參數(shù)自助法進(jìn)行模擬細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的分析，得出的R2值并帶有表示95%置信區(qū)表E.4：比例模型擬合的R2值（7R2GB/TXXXXX—XXXX圖E.7：基于縮放平滑殘差的絕對值之和（AbsSSR）計(jì)算的比例指數(shù)（PI），誤差棒表示由非參數(shù)自舉法分析得出的95%置信區(qū)間，用于模擬的(PIAbsssR)E.4.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析方法的文檔化(第7.2節(jié)i.探究的方法數(shù)量：4(方法5，方法6，ii.唯一目標(biāo)稀釋比例(dfi)的數(shù)量(I)：5iv.每個dfi下的重復(fù)測試樣本數(shù)量(ni)(表E6)v.每個dfi下每個重復(fù)測試樣本(j)的重復(fù)觀測數(shù)量(Kij)(表E7)表E.6：每個dfi下的重復(fù)測試樣本(j)數(shù)量GB/TXXXXX—XXXXnin13333n23333n33333n43333n53333表E.7：每個重復(fù)測試樣本(j)在每個dfi上的重復(fù)觀察值(KijK113333K123333K133333K213333K223333K233333K313333K323333K333333K413333K423333K433333K513333K523333K533333評價(jià)移液誤差對稀釋完整性貢獻(xiàn)的方法(7.2b)(模iv.基于與dfijpre—evaluated對dfi進(jìn)行比例模型擬合，計(jì)算得出R2Dilution（根據(jù)A1.2）v.用戶定義的稀釋完整性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為R2Dilution≥0.980。vi.稀釋完整性預(yù)評估研究結(jié)果見表E.8：移液誤差對稀釋完整性貢獻(xiàn)的用戶定義接受標(biāo)準(zhǔn)(7稀釋完整性驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)預(yù)評估稀釋完整性選擇計(jì)算平滑殘差的方法R2Dilution≥0.980R2Dilution≥0.990eismoothed用于對比例模型擬合(7.2c)中均方差關(guān)GB/TXXXXX—XXXXii.(λijproportional=β1*dfij)，系數(shù)如表E9所示表E.9：比例模型擬合方程(λijproportional=β1*dfij)基于非參數(shù)自舉的下限95%PI的計(jì)算方法(7.2e)：iv.計(jì)算PI的主要方法：按比例平滑殘差的絕對值之和（PIAbsSSR）v.平滑方法：基于測量稀釋比例進(jìn)行平滑處理（eijsmoothed）vi.計(jì)算的方程式：E.4.3關(guān)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程的7.2和7vii.儲備溶液濃度（細(xì)胞數(shù)/毫升）：約為2500000viii.估算儲備細(xì)胞濃度的方法：方法5v.獨(dú)立稀釋(模擬)細(xì)胞類型和濃度類型：iv.濃度類型：總細(xì)胞濃度測試樣iv.隨機(jī)樣本數(shù)(測量順序)：不適用(模擬)非GB/TXXXXX—XXXX指標(biāo)(即PI和R2)。通過評估兩種方法之間質(zhì)量指標(biāo)值的比率來比較方法。例如，通過計(jì)算兩種方法的PIPIAbsSSRMethodA和PIAbsSSRMethodB是PI值基于AbsSSR（方程式C1）計(jì)算的兩種計(jì)數(shù)方法。異。比值超過1表示方法A的PIAbsSSR較高（比例較低）而方法B較低，而比值低于1則表示方法A的PIAbsSSR較低（比例較高）而方法B較高。類似的比較可以應(yīng)為每種方法的質(zhì)量指標(biāo)生成95%置信區(qū)間(ci)。當(dāng)質(zhì)量指標(biāo)值之間的比值的95%CI(例如：RatioPIAbsSSR)表E.10：評估細(xì)胞計(jì)數(shù)方法R2之間的顯著差異。RatioR2基于非參數(shù)自舉分析下限95%CIRatioR2RatioR2是是是否否否RatioPIAbsSSR基于非參數(shù)自舉分析下