DB11 T 375-2006 水生動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)方法

備案號(hào)：19166-2006DB北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T375—2006水生動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)方法AquaticAnimalQuarantineDirectoryandDiseaseInspectionMethod2006-07-25發(fā)布2006-10-01實(shí)施北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB11/T375—2006本標(biāo)準(zhǔn)以《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》、《中華人民共和國(guó)漁業(yè)法》、《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》、《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲(chóng)病名錄》、《國(guó)際水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》為基礎(chǔ)，參考中華人民共和國(guó)動(dòng)物疫病的防疫檢疫相關(guān)法律、法規(guī)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合北京市水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的特點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)了水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)和流通中，需要嚴(yán)格控制、檢疫的疫病及其判定方本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、B、C、D、E、F、G、H、I、J均為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)局提出并歸口本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王姝、殷守仁、徐立蒲、盛竹梅、高南。1DB11/T375—2006水生動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了北京市二、三類水生動(dòng)物疫病名錄、病原檢測(cè)方法和報(bào)告單形式。本標(biāo)準(zhǔn)適用于北京地區(qū)各水產(chǎn)養(yǎng)殖單位、天然水域、垂釣休閑場(chǎng)所等，以及進(jìn)出北京的鮮活水產(chǎn)品及產(chǎn)品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T4789.7-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)GB/T15805.1-1995淡水魚(yú)類檢疫方法第一部分GB15984-1995霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織3檢疫名錄表1檢疫名錄二類疫病三類疫病4小瓜蟲(chóng)病[多子小瓜蟲(chóng)（Ichthyophthiriasismultifilii、刺激隱核蟲(chóng)（Cryptocaryonirritan]4檢測(cè)方法2DB11/T375—2006檢測(cè)方法具體見(jiàn)表2和表3。表2二類疫病檢測(cè)方法123456789霍亂弧菌（Vibriocholera）B/T4789.7-2003華枝睪吸蟲(chóng)（Clonorchissinensis）并殖吸蟲(chóng)（Paragonlmuswestermani）表3三類疫病檢測(cè)方法氣單胞菌病（Aeromonashydrophila）（Aeromonassalmonicida）粘孢子蟲(chóng)病蠕蟲(chóng)病5出具報(bào)告單3DB11/T375—2006表4病原檢測(cè)報(bào)告單報(bào)檢單位編號(hào)送檢單位編號(hào)4DB11/T375—2006（資料性附錄）草魚(yú)出血病的檢測(cè)A.1病原該病毒屬呼腸孤病毒科，介于呼腸孤病毒屬和輪狀病毒屬之間。A.2流行情況此病在南方多個(gè)省市均有流行，草魚(yú)、青魚(yú)都可發(fā)病，特別是在苗種培育階段危害性更大。它流行季節(jié)長(zhǎng)，發(fā)病率高，往往造成大批草魚(yú)魚(yú)種死亡。A.3臨床檢查A.3.1活動(dòng)情況及外部檢查魚(yú)的體色變黑，離群獨(dú)游，停止攝食，還伴有充血、出血癥狀。A.3.2剖檢病魚(yú)各器官組織有不同程度的充血、出血?？谇?、上下頜、頭頂部、眼眶周圍、鰓蓋、鰓及鰭條基部充血，有時(shí)眼球突出；剝除魚(yú)的皮膚，可見(jiàn)肌肉呈點(diǎn)狀或塊狀充血、出血，嚴(yán)重時(shí)肌肉呈鮮紅色，這時(shí)鰓常呈現(xiàn)“白鰓”；腸壁充血，但仍具韌性，腸內(nèi)無(wú)食物；腸系膜、周圍脂肪、鰾、膽囊、肝、脾、腎也有出血點(diǎn)或血絲。A.4實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)A.4.1病毒分離A.4.1.1細(xì)胞準(zhǔn)備A.4.1.1.1設(shè)備及器械無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、低溫冰箱和0.45um混合纖維素酯微孔濾膜、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、白色橡皮塞等。A.4.1.1.2培養(yǎng)基及試劑細(xì)胞生長(zhǎng)液、胰酶—EDTA混合消化液、小牛血清、L-谷氨酰胺等。A.4.1.1.3接種前的細(xì)胞準(zhǔn)備草魚(yú)出血病毒用草魚(yú)腎細(xì)胞株（CIK）細(xì)胞分離。最適培養(yǎng)溫度分別為20℃左右。選擇生長(zhǎng)良好，形成單層的細(xì)胞培養(yǎng)物，倒出生長(zhǎng)液加入適量胰酶－EDTA混合消化液消化，然后補(bǔ)加生長(zhǎng)液，按1：2或1：3的分種率將原瓶消化的細(xì)胞分裝入2個(gè)或3個(gè)培養(yǎng)瓶中，置室溫中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)單層致密度達(dá)80%左右，即可用于病毒接種。A.4.1.2樣品接種A.4.1.2.1設(shè)備及器械除了A.4.1.1.1規(guī)定的設(shè)備及器械外，另增加冷凍離心機(jī)和1.2mL規(guī)格的移液管。A.4.1.2.2常用的溶液細(xì)胞維持液、磷酸緩沖鹽水等。A.4.1.2.3取樣有癥狀的魚(yú)，取10尾以上樣品作病毒分離用。無(wú)癥狀的魚(yú)，取60尾以上樣品作病毒分離用。5DB11/T375—2006對(duì)魚(yú)卵，取60～100粒為樣品作病毒分離用。對(duì)于少量成魚(yú)，從尾動(dòng)脈抽1～2mL血液，其血漿作病毒分離用，血清作抗體檢測(cè)。A.4.1.2.4樣品處理——較大的魚(yú)取其腎、肝、脾等內(nèi)臟器官。仔、稚魚(yú)取魚(yú)體全部。魚(yú)卵必須去除卵黃囊?！Q重，加磷酸緩沖鹽水（PBS）勻漿，并稀釋成10-1，離心30min（4,000rpm），棄去沉淀物，將上清液通過(guò)0.45um微孔濾膜除菌，然后再用PBS進(jìn)行10倍稀釋，即成樣品?！簶悠分糜诔叵?h后，再放在4℃下12h以上，以析出血清。然后低速離心，其沉淀作待檢樣品，按上述方法制備樣品液，血清作中和試驗(yàn)。A.4.1.2.5接種細(xì)胞倒出細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)液，然后接種樣品液，接種量為維持液量的10-1，吸附1h后，加細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)對(duì)照。A.4.1.3病毒培養(yǎng)草魚(yú)出血病毒培養(yǎng)溫度是15℃~20℃。在培養(yǎng)過(guò)程中每日觀察細(xì)胞變化情況，觀察7d后，盲傳二A.4.1.4結(jié)果觀察若接種樣品含有病毒，培養(yǎng)2d～5d后，即出現(xiàn)明顯細(xì)胞致病變作用（CPE主要特征為細(xì)胞崩解，細(xì)胞單層破壞。收集陽(yáng)性細(xì)胞懸液，凍融一次后，低速離心除去細(xì)胞碎片，上清液作病毒鑒定用。若接種后7d仍未見(jiàn)CPE，則判斷為陰性結(jié)果。若7d內(nèi)出現(xiàn)可疑CPE現(xiàn)象，則需將該細(xì)胞瓶培養(yǎng)液作為接種材料再接種一次，以判斷是否有CPE。A.4.2病毒鑒定A.4.2.1中和試驗(yàn)I（固定血清用量——稀釋病毒法）本試驗(yàn)用于鑒定在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)了CPE的樣品是否含有草魚(yú)出血病毒。A.4.2.1.1試驗(yàn)準(zhǔn)備——細(xì)胞CIK細(xì)胞培養(yǎng)于96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上?！《居貌蒴~(yú)出血病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株，傳代后制成病毒懸液?！獦?biāo)準(zhǔn)抗血清抗草魚(yú)出血病毒的標(biāo)準(zhǔn)血清，使用前于56℃滅活60min?！龣z樣品（出現(xiàn)了CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物）凍融一次，除去細(xì)胞碎片后使用。A.4.2.1.2操作步驟A.4.2.1.2.1將待檢樣品用Hanks液作系列稀釋，使其稀釋度由10-1到10-3，每管含量為0.5mL。A.4.2.1.2.2取兩排試管，分別從上述各稀釋度的待檢樣品中取出0.2mL于兩排試管中，然后第一排試管加入0.2mL抗草魚(yú)出血病毒標(biāo)準(zhǔn)血清，第二排試管加入0.2mL維持液，充分混合均勻。A.4.2.1.2.330℃溫育60min。A.4.2.1.2.4溫育后分別將第一排管和第二排管的樣品接種于已長(zhǎng)滿草魚(yú)出血病毒細(xì)胞單層的96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度4孔，每孔0.1mL。A.4.2.1.2.5將抗草魚(yú)出血病毒標(biāo)準(zhǔn)血清倍比稀釋后（1：8至1：64）接種于上述培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度4孔，每個(gè)孔0.05mL，作為標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照。將標(biāo)準(zhǔn)草魚(yú)出血病毒接種8孔，每孔0.05mL，作為病毒對(duì)照，其余8孔作為正常細(xì)胞對(duì)照。A.4.2.1.2.6每孔加入維持液至總量0.2mL。A.4.2.1.2.7放入20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察病變，記錄結(jié)果（按附表A.1填寫(xiě)）。6DB11/T375—2006列ABCDEFGHA.4.2.1.3結(jié)果判定按Reed和Muench法分別結(jié)算出待檢樣品——標(biāo)準(zhǔn)血清與待檢樣品——維持液的細(xì)胞半數(shù)致死量（TCID50二者的滴度指數(shù)之差的反對(duì)數(shù)即為中和指數(shù)。若正常細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照為陰性，標(biāo)準(zhǔn)毒對(duì)照為陽(yáng)性，按表A.2判定結(jié)果。表A.2結(jié)果判定中和指數(shù)結(jié)果判定<10陰性（待檢者不帶毒）10～50可疑>50A.4.2.2中和試驗(yàn)II（固定病毒——稀釋血清法）本試驗(yàn)用于鑒定魚(yú)血清中是否含有抗草魚(yú)出血病毒的中和抗體。A.4.2.2.1試驗(yàn)準(zhǔn)備——細(xì)胞CIK細(xì)胞培養(yǎng)于96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上?！《緲?biāo)準(zhǔn)草魚(yú)出血病毒，使用前用Hanks液稀釋至50TCID50/0.1mL?！宕龣z血清和正常血清（陰性血清）用等量的Hanks液（每毫升含青霉素200IU、鏈霉素200mg）稀釋后，于45℃滅活30min，待冷卻后使用。A.4.2.2.2操作步驟A.4.2.2.2.1將已滅活處理的待檢血清，用Hanks液作系列倍比稀釋，使其稀釋度由1：4到1：256，每管含量為0.2mL。A.4.2.2.2.2分別在上述各管中加0.2mL（即為待檢血清等量）的TCID500.1mL的草魚(yú)出血病毒懸液，充分搖勻混合。A.4.2.2.2.3于30℃溫育60min。A.4.2.2.2.4取出后分別接種于長(zhǎng)滿RTG－2細(xì)胞單層的96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度4孔，每孔0.A.4.2.2.2.5按上述步驟設(shè)立正常血清對(duì)照；將標(biāo)準(zhǔn)草魚(yú)出血病毒懸液連續(xù)10倍稀釋后（10-1～10-7）接種上述培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度4孔，每孔0.1mL，作為病毒懸液毒力滴度對(duì)照；96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板H排12孔作為正常細(xì)胞對(duì)照。A.4.2.2.2.6各孔加入細(xì)胞維持液至總量0.2mL。A.4.2.2.2.7放入20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察病變，記錄結(jié)果（按表A.3填寫(xiě)）。7DB11/T375—2006表A.3中和試驗(yàn)II結(jié)果記錄表列9A1HA.4.2.2.3結(jié)果判定根據(jù)病變用Reed－Muench法或Karber法計(jì)算出血清中抗體效價(jià)（即能保護(hù)50%的細(xì)胞培養(yǎng)孔不產(chǎn)生病變的最高血清稀釋度）。血清中和抗體效價(jià)大于或等于1：6者為陽(yáng)性，小于1：6者為陰性。A.4.3綜合判定——若出現(xiàn)上述臨床癥狀，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)又出現(xiàn)CPE，并經(jīng)中和試驗(yàn)為陽(yáng)性者判定為草魚(yú)出血病陽(yáng)性?！魺o(wú)臨床癥狀，但經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE，并經(jīng)中和試驗(yàn)為陽(yáng)性者判定為草魚(yú)出血病毒攜帶者。——若中和試驗(yàn)可疑，則判定為可疑?！魞H有臨床癥狀，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)也不出現(xiàn)CPE，但魚(yú)血清中抗草魚(yú)出血病毒中和抗體為陽(yáng)性者，則判定在近期內(nèi)患過(guò)草魚(yú)出血病。——若僅有臨床癥狀，或僅能在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)CPE，但不能被抗草魚(yú)出血病毒中和抗體中和者，則不能稱患有草魚(yú)出血病，需進(jìn)一步做其他病檢查。8DB11/T375—2006（資料性附錄）吸蟲(chóng)病的檢測(cè)B.1并殖吸蟲(chóng)的檢測(cè)B.1.1病原衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)（Paragonlmuswestermani）。B.1.2流行情況及生活史并殖吸蟲(chóng)寄生于人、犬、貓及多種野生動(dòng)物的肺組織內(nèi)。本蟲(chóng)主要分布于東亞和東南亞諸國(guó)，在我國(guó)的東北、華北、華南、中南及西南等地區(qū)的18個(gè)省與自治區(qū)均有報(bào)道，是一種重要的人畜共患吸蟲(chóng)病。衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)的發(fā)育需要兩個(gè)中間宿主：第一中間宿主是淡水螺類，第二中間寄主是甲殼類。終宿主（比如人、貓、犬、等）吃下含囊蚴的溪蟹及刺蛄等，囊蚴便在腸內(nèi)破囊而出。B.1.3實(shí)驗(yàn)室檢查B.1.3.1配制試劑B.1.3.1.1生理鹽水的配制稱取氯化鈉8.5g，溶于1000ml蒸餾水中即可。B.1.3.1.2碘液的配制分別稱取4g碘化鉀和2g碘，并量取蒸餾水100ml，先將碘化鉀溶于水中，然后再加碘，溶解后貯存于棕色瓶中備用。B.1.3.2制片B.1.3.2.1剪取甲殼動(dòng)物的頭胸部軟組織和肌肉，勻漿，加入少量生理鹽水，并混合均勻，靜置或微離心以除去雜質(zhì)。取上清液再次輕微離心，將包囊沉淀下來(lái)，去掉上清液，用生理鹽水重懸沉淀。B.1.3.2.2在潔凈的載玻片上滴加1滴上述的樣品液，在其上滴1滴碘液，涂布均勻，覆以蓋玻片。B.1.3.3鏡檢在碘液涂片中，包囊的胞漿被染成黃色或淺褐色，糖原泡為棕色，囊壁、核仁和擬染色體均不著色?？梢钥吹桨覂?nèi)的雛形蟲(chóng)體。蟲(chóng)體肥厚，腹面扁平，背面隆起，體表被有小棘，以單生棘為主?？?、腹吸盤(pán)大小略同，腹吸盤(pán)位于體中橫線稍前，兩盲腸形成3-4個(gè)彎曲，終于體末端。尚無(wú)繁殖系統(tǒng)。B.2華枝睪吸蟲(chóng)的檢測(cè)B.2.1病原華枝睪吸蟲(chóng)（Clonorchissinensis）。B.2.2流行情況及生活史華枝睪吸蟲(chóng)寄生于人、犬、貓、豬等的肝膽管和膽囊內(nèi)，可使肝臟腫大并導(dǎo)致其它肝病變，是一種重要的人畜共患吸蟲(chóng)病。主要分布于東亞諸國(guó)，在我國(guó)的流行也極為廣泛。華枝睪吸蟲(chóng)的蟲(chóng)卵隨糞便排出后，被第一中間宿主淡水螺吞食后，在螺體內(nèi)孵出毛蚴，繼續(xù)發(fā)育成胞蚴、雷蚴和尾蚴。尾蚴自螺體逸出后，侵入第二中間寄主魚(yú)體，并發(fā)育為囊蚴。囊蚴分布在魚(yú)體的肉、頭、皮、鰭及鱗等處，其中的魚(yú)肉及魚(yú)頭最多?？杀荒因矢腥镜闹饕乔?、草、鯉、鯽、鳊、鯪、鳙等。終宿主（比如人、貓、犬、豬等）吃下含囊蚴的魚(yú)肉，外囊膜溶化后，蚴蟲(chóng)由內(nèi)囊膜逸出，然后在膽道內(nèi)發(fā)育為成蟲(chóng)。B.2.3臨床檢查病魚(yú)活動(dòng)異常，攝食減少。解剖后能在頭部和肌肉內(nèi)發(fā)現(xiàn)硬硬的包囊。B.2.4實(shí)驗(yàn)室檢查9DB11/T375—2006B.2.4.1配制試劑B.2.4.1.1生理鹽水的配制稱取氯化鈉8.5g，溶于1000ml蒸餾水中即可。B.2.4.1.2碘液的配制分別稱取4g碘化鉀和2g碘，并量取蒸餾水100ml，先將碘化鉀溶于水中，然后再加碘，溶解后貯存于棕色瓶中備用。B.2.4.2制片B.2.4.2.1將魚(yú)的肌肉和頭部剪成小塊，勻漿，加入少量生理鹽水，并攪拌均勻，靜置或微離心以除去雜質(zhì)。取上清液再次輕微離心，將包囊沉淀下來(lái)，去掉上清液，用生理鹽水重懸沉淀。B.2.4.2.2在潔凈的載玻片上滴加1滴上述的樣品液，在其上滴1滴碘液，涂布均勻，覆以蓋玻片。B.2.4.3鏡檢在碘液涂片中，包囊的胞漿被染成黃色或淺褐色，糖原泡為棕色，囊壁、核仁和擬染色體均不著色?？梢钥吹桨覂?nèi)的雛形蟲(chóng)體。蟲(chóng)體背腹扁平，呈葉狀，前端稍尖，后端較鈍，體被無(wú)棘，透明?？谖P(pán)略大于腹吸盤(pán)，腹吸盤(pán)位于體前端1/5處，消化器官包括口、咽和短的食道及兩腸支，腸支伸達(dá)蟲(chóng)體后端。尚無(wú)繁殖系統(tǒng)。DB11/T375—2006（資料性附錄）鯉痘瘡病的檢測(cè)C.1病原鯉皰疹病毒（H.cyprini）。C.2流行情況此病流行于歐洲，現(xiàn)在日本及我國(guó)均有病例發(fā)生，主要危害鯉魚(yú)、鯽魚(yú)等，影響魚(yú)的生長(zhǎng)及降低魚(yú)的商品價(jià)值，在越冬后期可引起病魚(yú)死亡。C.3臨床檢查早期病魚(yú)的體表出現(xiàn)小的斑點(diǎn)，以后變厚、增大，其形狀及大小各異，直徑可從1厘米左右到數(shù)厘米，厚1-5厘米左右，嚴(yán)重時(shí)可融合成一片。增生物表面原為光滑，后來(lái)變得有些粗糙，玻璃樣或蠟樣，有時(shí)不透明；顏色為淺乳白色、奶油色，以至褐色。C.4實(shí)驗(yàn)室檢查C.4.1石蠟組織切片將分離的體表增生物進(jìn)行固定、脫水、透明等處理后，石蠟切片，H.E.染色，鏡下觀察?？梢钥吹皆錾餅樯掀ぜ?xì)胞和結(jié)締組織增生，有些上皮細(xì)胞的核內(nèi)有包涵體。C.4.2透射電鏡觀察增生物超薄切片，在透射電鏡下可見(jiàn)在嚴(yán)重變性的細(xì)胞內(nèi)有皰疹病毒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張粗糙，線粒體腫脹，嵴不清楚，核糖體增多，核內(nèi)僅顯示少量周邊染色質(zhì)。DB11/T375—2006（資料性附錄）鰓霉病的檢測(cè)D.1病原鰓霉菌（Branchiomycessp.）D.2流行情況通過(guò)孢子與鰓直接接觸而感染。主要在夏秋季流行，當(dāng)水質(zhì)惡化時(shí)易暴發(fā)此病。該病出現(xiàn)往往是急性的，如條件合適一兩天內(nèi)即可大量繁殖，魚(yú)苗即出現(xiàn)暴發(fā)性急性死亡。D.3癥狀病魚(yú)不喜攝食，游動(dòng)緩慢，呼吸困難。鰓出血或失血，鰓上粘液增多，部分鰓絲發(fā)白并腐爛。D.4實(shí)驗(yàn)室檢查先用肉眼觀察魚(yú)的鰓部，如出現(xiàn)上述癥狀則必須進(jìn)行鏡檢。剪少許鰓絲，蓋上蓋玻片在顯微鏡下檢查。當(dāng)發(fā)現(xiàn)鰓上有大量分枝狀菌絲寄生時(shí)即可做出診斷。DB11/T375—2006（資料性附錄）嗜水氣單胞菌的檢測(cè)E.1病原嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）E.2流行情況該細(xì)菌能危害多種淡水、海水魚(yú)類，還感染一些軟體動(dòng)物和兩棲動(dòng)物。本菌在世界各地廣泛存在，它是條件性致病菌，魚(yú)類感染后一般不發(fā)病，一旦環(huán)境污染，魚(yú)體抵抗力降低，就會(huì)爆發(fā)性發(fā)病。E.3臨床檢查病魚(yú)皮膚出血、腹部膨大，鱗片外豎，眼球突出。慢性的表現(xiàn)為皮膚潰瘍。剖檢后可見(jiàn)肝、腎蒼白或因膽汁浸潤(rùn)而變綠，腎腫大發(fā)脆。由于細(xì)菌毒素的作用而肝、腎內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到破壞。魚(yú)的鰓、腹膜和肌肉呈點(diǎn)狀出血。體腔充滿血樣滲出液，后腸和肛門(mén)腫大、發(fā)炎、出血。肛門(mén)外翻，腸道內(nèi)充滿粘液樣物質(zhì)。E.4實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)E.4.1病料的采集和處理采取病魚(yú)的腎、肝、脾、鰓、腹膜等。E.4.2病原菌分離病魚(yú)的腎、肝、脾等研碎，制成混懸液，接種血瓊脂或添加10mg/L氨芐青霉素的血瓊脂、腦心浸液或胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，放于28℃條件下培養(yǎng)24h，挑選革蘭氏陰性菌落，接種細(xì)菌快速診斷系統(tǒng)API-50E試劑盒，進(jìn)行確診。E.4.3病原鑒定E.4.3.1顯微鏡檢查取培養(yǎng)的菌落或直接取病料涂片，革蘭氏染色，鏡檢?？梢?jiàn)革蘭氏陰性短桿菌，單個(gè)或成對(duì)排列，長(zhǎng)約0.5μm-1μm。極端單鞭毛，有運(yùn)動(dòng)性。無(wú)莢膜，不產(chǎn)生芽胞。E.4.3.2生化試驗(yàn)取培養(yǎng)的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，革蘭氏染色陰性，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，對(duì)新霉素或弧菌抑制劑0/129不敏感。生長(zhǎng)Ph5.5-9.0，多數(shù)菌株具有血凝性，在甘露糖存在的條件下7.4℃或22℃均能凝集牛、雞、人型及豚鼠的紅細(xì)胞。E.4.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將一定濃度的嗜水氣單胞菌抗原溶于包被緩沖液中，加入微量滴定板，每孔100μl，放于4℃條件下作用12h，然后用PBS液洗滌3次，甩干。接著各孔加入包被物相對(duì)應(yīng)的待檢血清100μl，37℃條件下作用1h-2h，同上法用PBS液洗滌3次，根據(jù)試驗(yàn)可加入1層、2層或更多層次，每加一層需同上法反應(yīng)、洗滌。最后一層必須加入與前一層相對(duì)的酶標(biāo)記抗體，在37℃條件下作用1h-2h，再用PBS液洗滌3次，最后各孔加入底物鄰笨二胺溶液100μl，放于室溫20min-30min，加入2MH2SO450μl終止反應(yīng)，進(jìn)行觀察，判定。E.5結(jié)果判定DB11/T375—2006在ELISA檢測(cè)儀上指定波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，用鄰笨二胺做底物，所用波長(zhǎng)為490nm，用肉眼進(jìn)行判斷，呈橙色或黃色為陽(yáng)性（+）；淺黃色或接近無(wú)色，與對(duì)照無(wú)顯著差異，可判定為陰性（-）。DB11/T375—2006（資料性附錄）小瓜蟲(chóng)病的檢測(cè)F.1病原體多子小瓜蟲(chóng)（Ichthyophthiriasismultifiliis）、刺激隱核蟲(chóng)（Cryptocaryonirritans）。F.2流行情況小瓜蟲(chóng)寄生在淡水、海水魚(yú)的鰓、皮膚、鰭、口腔等處，對(duì)魚(yú)的種類及年齡均無(wú)嚴(yán)格選擇性，分布很廣，幾乎遍及全國(guó)各地，尤以不流動(dòng)的小水體、高密度養(yǎng)殖的幼魚(yú)及觀賞魚(yú)類為嚴(yán)重，常引起大批死亡。國(guó)外也很普遍。小瓜蟲(chóng)的繁殖適溫為15℃-25℃,因此流行于春、秋季。小瓜蟲(chóng)借助胞囊及幼蟲(chóng)傳播，剛孵出的幼蟲(chóng)侵襲力較強(qiáng)。F.3臨床檢查小瓜蟲(chóng)寄生處形成1mm以下的小白點(diǎn)，故叫白點(diǎn)病。當(dāng)病情嚴(yán)重時(shí)，軀干、頭部、鰓、口腔等處都布滿小白點(diǎn)，并同時(shí)伴有大量粘液，表皮糜爛、脫落；病魚(yú)體色發(fā)黑，消瘦，游動(dòng)異常，最后病魚(yú)呼吸困難而死。F.4實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)F.4.1初診病魚(yú)體表、鰓上布滿白色點(diǎn)狀的蟲(chóng)體、胞囊，肉眼可見(jiàn)一個(gè)個(gè)小白點(diǎn)。體表粘液明顯增多，與蟲(chóng)體混在一起，似有一層薄膜。F.4.2確診刮取少量粘液或?qū)姨羝坪笤阽R下觀察，可見(jiàn)小瓜蟲(chóng)身體柔軟，可以任意變形，全身密布纖毛，纖毛不斷波動(dòng)，運(yùn)動(dòng)隨意，體內(nèi)有一個(gè)呈馬蹄形的大核。DB11/T375—2006（資料性附錄）絳蟲(chóng)病的檢測(cè)G.1病原九江頭槽絳蟲(chóng)（Bothriocephalusgowkongensis）、闊節(jié)裂頭絳蟲(chóng)（Diphyllobothriumlatum）。G.2流行情況九江頭槽絳蟲(chóng)原是兩廣的地方性魚(yú)病，現(xiàn)已傳播到其他地區(qū)，東歐一些國(guó)家也有它的報(bào)道。該蟲(chóng)寄生在草魚(yú)、青魚(yú)、鰱、鳙、鯪的腸內(nèi)，以草魚(yú)魚(yú)種受害最為嚴(yán)重。草魚(yú)在育苗初期即開(kāi)始感染，而且在短期內(nèi)大部分能發(fā)展到嚴(yán)重階段。闊節(jié)裂頭絳蟲(chóng)主要對(duì)人類造成危害。流行于歐洲一些國(guó)家，如芬蘭、法國(guó)、意大利等國(guó)，在我國(guó)和日本也有少數(shù)病例。該蟲(chóng)可寄生于多種淡水魚(yú)類，如狗魚(yú)、江鱈、鱸魚(yú)等。G.3臨床檢查魚(yú)體重減輕，非常瘦弱，不喜攝食，體色發(fā)黑，離群獨(dú)游，口常張開(kāi)，伴有惡性貧血現(xiàn)象。當(dāng)嚴(yán)重寄生時(shí)，魚(yú)腸前端第一盤(pán)曲膨大成胃囊狀，直徑較正常增大約3倍，并使前腸壁異常擴(kuò)張，形成皺襞萎縮。此外，腸前端還出現(xiàn)慢性炎癥。由于腸內(nèi)密集蟲(chóng)體，造成機(jī)械堵塞。闊節(jié)裂頭絳蟲(chóng)的裂頭蚴寄生在魚(yú)的結(jié)締組織、肌肉、性腺、肝等處，當(dāng)哺乳動(dòng)物吞食感染裂頭蚴的淡水魚(yú)就受其感染。G.4實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)九江頭槽絳蟲(chóng)蟲(chóng)體帶狀，體長(zhǎng)20mm-250mm。頭節(jié)有1明顯的頂盤(pán)和2個(gè)較深的吸溝。精巢球形，每個(gè)節(jié)片內(nèi)有50個(gè)-90個(gè)，分布在節(jié)片的兩側(cè)。陰道和陰莖共同開(kāi)口在生殖腔內(nèi)。生殖腔開(kāi)口在節(jié)片背面中線后1/3的任何一點(diǎn)上。卵巢雙瓣翼狀，開(kāi)口于節(jié)片后端1/4的中央腹面，在生殖孔之前。卵黃腺比精巢小，散布在節(jié)片的兩側(cè)。梅氏腺位于卵巢的前側(cè)。闊節(jié)裂頭絳蟲(chóng)體長(zhǎng)2m-20m，有4000多個(gè)節(jié)片；頭節(jié)長(zhǎng)圓形，背腹各有1條深裂的吸溝。每個(gè)節(jié)片內(nèi)有1套生殖器官；精巢圓形，泡沫狀，很多，散布在節(jié)片背面兩側(cè)，肌肉質(zhì)的陰莖囊包含有陰莖，它開(kāi)口于節(jié)片中央的上方，雌雄生殖孔在它的后方，卵巢兩瓣?duì)?，位于?jié)片后端1/3的腹面，陰道開(kāi)口于生殖腔的生殖孔，子宮開(kāi)口于生殖孔后方不遠(yuǎn)的腹中線。卵黃腺呈小圓粒狀，散布在節(jié)片的兩側(cè)精巢的腹面。DB11/T375—2006（資料性附錄）粘孢子蟲(chóng)病的檢測(cè)H.1病原碘泡蟲(chóng)（Myxobolusspp）、單極蟲(chóng)（Thelohanellidaespp）。H.2流行情況碘泡蟲(chóng)的種類比較多，包括鰱碘泡蟲(chóng)、餅形碘泡蟲(chóng)、鯽碘泡蟲(chóng)、圓形碘泡蟲(chóng)、異形碘泡蟲(chóng)等。它能感染多種魚(yú)類，寄生在魚(yú)的鰓、皮膚、腦、肝膽、脾等處。一般無(wú)明顯的季節(jié)性，全年均可發(fā)生。它能造成魚(yú)的死亡，也能使魚(yú)因外觀丑陋而失去商品價(jià)值。單極蟲(chóng)寄生于鯉魚(yú)、鯽魚(yú)的鱗下或腸壁上，全國(guó)流行。H.3臨床檢查被碘泡蟲(chóng)寄生的魚(yú)體表有大小不一、肉眼可見(jiàn)的白色胞囊，手摸患處很柔軟，好象要漲破一樣。嚴(yán)重時(shí)病魚(yú)離群獨(dú)游，體瘦弱，活動(dòng)異常，腸內(nèi)無(wú)食，鰓呈紅色，粘液增多，呼吸困難。鯪單極蟲(chóng)病在鱗下形成許多淡黃色大胞囊，寄生處的鱗片豎起。吉陶單極蟲(chóng)病形成很多大胞囊突出于腸腔內(nèi)，將腸管堵塞脹粗，腸壁變薄而透明，腹腔積水，肝蒼白。H.4實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)將胞囊壓成薄片，用顯微鏡進(jìn)行檢查、確診。粘孢子蟲(chóng)的共同特征1）每一孢子有2塊-7塊幾丁質(zhì)殼片，兩殼連接處叫縫線，縫線由于粗厚或突起呈脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)?？p脊大多數(shù)種類是直的，少數(shù)種類彎曲成“S”形；（2）有些種類的殼上有條紋、褶皺或尾狀突起3）每孢子有1個(gè)-7個(gè)球形、梨形、瓶形的極囊，通常位于孢子前端。極囊里有極絲，作螺旋狀盤(pán)曲，受刺激后能通過(guò)極囊射出4）極囊以外充滿胞質(zhì)，內(nèi)有2個(gè)胚核，有的種類在胞質(zhì)里還有1個(gè)嗜碘泡。DB11/T375—2006（資料性附錄）原蟲(chóng)病的檢測(cè)斜管蟲(chóng)（Chilodonellacyprini）、車輪蟲(chóng)（Trichodinaspp）。國(guó)內(nèi)外斜管蟲(chóng)病都有發(fā)生，對(duì)溫水性及冷水性淡水魚(yú)都可造成危害，主要危害魚(yú)苗、魚(yú)種，流行于春秋季節(jié)。當(dāng)水質(zhì)惡劣、魚(yú)體衰弱時(shí)，在夏季及冬季冰下也會(huì)發(fā)生斜管蟲(chóng)病，引起魚(yú)大量死亡。車輪蟲(chóng)寄生在多種淡水魚(yú)、海水魚(yú)的鰓和體表，主要危害魚(yú)苗、魚(yú)種，嚴(yán)重感染時(shí)可引起病魚(yú)大批死亡，但一般危害不大。全國(guó)各地均有發(fā)生。引起病魚(yú)大批死亡主要是在熱天。車輪蟲(chóng)在水中可生活1天-2天，通過(guò)直接與魚(yú)體接觸而感染，可隨水、水中生物及工具等傳播。斜管蟲(chóng)寄生在魚(yú)的鰓和皮膚上，有大量粘液，表皮發(fā)炎，壞死脫落，呼吸困難。少量寄生時(shí)沒(méi)有明顯癥狀；嚴(yán)重感染時(shí)，可引起寄生處粘液增多。病魚(yú)游動(dòng)緩慢，呼吸困難，魚(yú)成群結(jié)隊(duì)圍繞池邊狂游，呈“跑馬”癥狀；車輪蟲(chóng)在魚(yú)的鰓及體表各處不斷爬動(dòng)，損傷上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞及粘液細(xì)胞增生，分泌亢進(jìn)，鰓上的毛細(xì)血管充血、滲出。嚴(yán)重時(shí)一大片上皮細(xì)胞壞死。刮取鰓和體表粘液，制片，鏡下觀察。斜管蟲(chóng)蟲(chóng)體側(cè)面觀背面隆起，腹面