酶標(biāo)儀（培訓(xùn)課件）

酶標(biāo)儀酶免疫分析是基于酶催化反應(yīng)的特性來進(jìn)行檢測(cè)和定量分析免疫反應(yīng)。在實(shí)踐上，首先要讓酶標(biāo)記的抗體或抗原與相應(yīng)的配體（抗原或抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后再加入酶底物。酶催化反應(yīng)發(fā)生后，可通過檢測(cè)下降的酶底物濃度或升高的酶催化產(chǎn)物濃度來達(dá)到檢測(cè)或定量分析抗原抗體反應(yīng)的目的。一、酶免疫分析的基本原理酶是一種能催化化學(xué)反應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)，其催化效力超過目前所有的人造催化劑，一般可使反應(yīng)加速108一1010倍。此外，酶還具有高度的專一性，即每一種酶只催化一種或一組密切相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)。免疫技術(shù)是利用Ag-Ab反應(yīng)進(jìn)行的檢測(cè)方法，特點(diǎn)是具有高度的特異性和敏感性。如將Ag或Ab用標(biāo)記物(如熒光素、酶、放射性同位素等)進(jìn)行標(biāo)記，則在與標(biāo)本中的相應(yīng)Ab或Ag反應(yīng)后，可以不必測(cè)定Ag-Ab復(fù)合物本身，而測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。

EIA是將酶催化的放大作用與抗原、抗體的免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗體或抗原后，既不影響抗體或抗原的免疫反應(yīng)特異性，也不改變酶本身的催化活性，即在相應(yīng)的反應(yīng)底物參與下，標(biāo)記的酶可以使底物基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩难趸停@種有色產(chǎn)物可以通過肉眼、光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)行觀察，也可以用分光光度計(jì)加以測(cè)定。呈色反應(yīng)顯示了反應(yīng)體系中酶，即被標(biāo)記的抗體（或抗原）的存在，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫學(xué)反應(yīng)。因此，EIA是一種特異而敏感的檢測(cè)技術(shù)，可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，也可以在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行半定量、定量測(cè)定。二、酶免疫分析方法中的主要組成部分

（－）固相載體非均相EIA免疫實(shí)驗(yàn)所用的固相載體應(yīng)具備以下條件：①可結(jié)合抗體（抗原）的容量大、種類多；②可將抗體（抗原）牢固地固定在其表面，雖經(jīng)長(zhǎng)期保存和多次洗滌也不脫落；③不影響所固定抗體（抗原）的免疫反應(yīng)性；④抗體的Fc段（或抗原）被固定在載體上時(shí)其與抗原（抗體）的結(jié)合空間位點(diǎn)應(yīng)朝向反應(yīng)液。常用的材料有：

1．塑料如由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的微孔反應(yīng)板（48孔、96孔）或小珠、小試管等產(chǎn)品，是目前應(yīng)用最廣、最普及的一種固相載體，主要通過非共價(jià)鍵吸附抗原或抗體。該類載體的應(yīng)用可以簡(jiǎn)化整個(gè)EIA的操作步驟，使之易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

2、可磁化顆?；颦傊侵檫@類固相載體通過共價(jià)鍵結(jié)合抗原或抗體，在檢測(cè)中可分散到整個(gè)反應(yīng)混合液中，有很大的表面積，結(jié)合容量較大，因此結(jié)合較為有效，使免疫反應(yīng)得以迅速進(jìn)行；但制備固相抗體有較嚴(yán)格的技術(shù)要求。（二）包被蛋白經(jīng)過純化后，大部分抗原、抗體都可作為ELA反應(yīng)的包被蛋白?？乖蚩贵w的濃度高，吸附在載體表面的也越多。（三）待測(cè)樣品

EIA中的待測(cè)樣品可以為細(xì)胞、血清、腦脊液、胸腹水及其他體液中的任何抗原、抗體，某些反應(yīng)，如間接法檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體（抗-HCV）、競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)乙型病毒性肝炎核心區(qū)外型抗體（抗-HBcIgG）等需要對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行分析.（四】酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物是指將酶通過某些化學(xué)物（交聯(lián)劑）和抗原、抗體、Fab片段等蛋白結(jié)合在一起的復(fù)合物，利用該復(fù)合物可以檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的免疫反應(yīng)原性蛋白。目前常用的交聯(lián)劑有：戊二醛、氟二硝基苯、過碘酸鈉等。（五）各種緩沖液如：包被液、封閉液、稀釋液、洗液、顯色底物和緩沖液、終止液等。三、酶免疫分析技術(shù)（－）均相EIA均相EIA技術(shù)的測(cè)定對(duì)象為小分子抗原或半抗原，主要用于藥物測(cè)定。當(dāng)酶與半抗原聯(lián)結(jié)形成的酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗體反應(yīng)后，由于抗體分子的空間阻礙效應(yīng)或因酶的構(gòu)型發(fā)生變化而激發(fā)或妨礙了它與底物的作用。因此，發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)后的酶呈激活或抑制狀態(tài)，增強(qiáng)或不能催化底物的呈色反應(yīng)；當(dāng)加入樣品后，樣品中的半抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合可與酶標(biāo)記物反應(yīng)的抗體，此時(shí)酶標(biāo)記物就不再結(jié)合抗體分子，從而使酶標(biāo)記物解除了激活或抑制狀態(tài)，重新變?yōu)槌跏紶顟B(tài)，因此，在此實(shí)驗(yàn)中無需分離即可直接測(cè)定發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的（二）異相EIA

1．競(jìng)爭(zhēng)性EIA檢測(cè)方法

1）酶標(biāo)記抗原的競(jìng)爭(zhēng)性EIA

在這種EIA中，將含特異性抗體的免疫球蛋白包被在固相載體上，然后以不同比例加人含待測(cè)抗原和酶標(biāo)記抗原的溶液，過量的酶標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原與限量的、包被在固相載體上的抗體一起溫育，由于油結(jié)合位點(diǎn)數(shù)比總的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)少，因此，Ag－E與Ag互相競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。洗去游離的Ag－E和Ag后，測(cè)定固相抗體結(jié)合的Ag－E酶的活性，即可對(duì)被測(cè)Ag進(jìn)行定量。其示意圖如圖1所示。

圖1競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原2．非爭(zhēng)性EIA檢測(cè)方法

1）直接法這與免疫熒光技術(shù)的直接法相似，將所選擇的酶標(biāo)記抗體與相應(yīng)的抗原共同孵育，然后用該酶的特殊底物進(jìn)行顯色，揭示抗原一抗體復(fù)合物的存在。2）雙抗體夾心法①將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。然后洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。③加受檢標(biāo)本使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。然后洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。③加酶標(biāo)抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。然后徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。。此時(shí)，固相載體上帶有的酶量就代表標(biāo)本中受檢抗原的量。④加底物顯色。夾心式復(fù)合物中的酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。‘圖2雙抗體夾心法測(cè)抗原測(cè)量原理光密度檢測(cè)利用了Labsystems傳統(tǒng)垂直光密度檢測(cè)的概念，即光束經(jīng)過整個(gè)標(biāo)本的垂直測(cè)光法。在垂直測(cè)光法中，光的吸收與板孔中吸光物質(zhì)的多少成比例。吸光值由以下公式表示：A=(a/s)×mA=(a/s)×m式中，