ch03_培養(yǎng)細胞生物學特征

1、培養(yǎng)細胞的生物學特征,洋蔥的表皮細胞,植物輸導水分的細胞,哺乳類的肌肉細胞,人類脊髓神經細胞,體外培養(yǎng)細胞的分型,（一）貼附型： 大多數培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按照體內組織學標準判定，僅大致分成以下四型：,粘附:是大多數有機體細胞在體內 生存和生長發(fā)育的基本存在方式 結果: 基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織，有機體的絕大多數細胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長。,培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細胞 粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細胞,類型 細胞在

2、體內、外的粘附方式：存在差異 體內：粘附是全方位,外形具有復雜的立體特征 體外：多數情況，細胞只有一個附著平面 外形一般與體內時明顯不同 按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型,1、成纖維細胞型： 胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的 來源：由中胚層間充質組織起源的組織如： 真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞， 血管內皮 形態(tài)：似體內成纖維細胞的形態(tài)，胞體梭形

3、或不規(guī)則 三角形，胞質向外伸出23個長短不等的突起， 中有卵圓形核 生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片， 細胞細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨 的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起,成纖維細胞,2、上皮型細胞： 細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。,名稱：僅形態(tài)上似體內，實際上不完全相同 來源：來源于外胚層、內胚層細胞, 如： 皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤 形態(tài)：類似體內的上皮細胞扁

4、平，不規(guī)則多角形，中有圓 形核 生長特點：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動,上皮型細胞,3、游走細胞型： 呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。 4、多型細胞型： 有一些細胞，如神經細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,（二）懸浮型： 見于少數特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。,概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫

5、細胞也可能 特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團 優(yōu)點：生存空間大，提供數量大，傳代方便(不需消化)， 易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點：觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細 胞),Hepatocytes,培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程,（一）培養(yǎng)細胞生命期（Life Span of Culture Cells） 所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。,1原代培養(yǎng)（Primary Culture）期： 也稱初代培養(yǎng)，即從體內取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內原組織在形態(tài)結構和功能活動

6、上相似性大。細胞群是異質的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細胞獨立生存性差?？寺⌒纬陕始醇毎罕幌♂尫稚⒊蓡蝹€細胞進行培養(yǎng)時，形成細胞小群（克?。┑陌俜謹怠３醮囵B(yǎng)細胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細胞和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。,2傳代期： 初代培養(yǎng)細胞一經傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞

7、稱二倍體細胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發(fā)生轉化。一般情況下當傳代1050次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。,3衰退期： 此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化（Spontaneous Transformation）。轉化的標

8、志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細胞系（Continuous Cell Line）。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉化亦可用人工方法誘發(fā)，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。,（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期,所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細

9、胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增36次。細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：,?,1潛伏期（Latent Phase）： 細胞接種培養(yǎng)后，先經過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質等密切相關。,初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達1024小時或更多；連續(xù)細胞系和惡性細胞系快，1030分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個非常復

10、雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如 CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。,初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約2496小時或更長，連續(xù)細

11、胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅624小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現并逐漸增多時，標志細胞已進入指數增生期。,原因: 操作時，細胞表面上與其它細胞及支持物黏附與連接的分子被破壞，細胞受到損傷 接種細胞: 適應，恢復，積累(代謝中間產物) 組織塊: 細胞遷移出 一般經數小時-幾天,過程: 游離:懸浮,胞質回縮, 全部細胞變?yōu)閳A球形 吸附:貼附底物,一般24小時內貼壁 潛伏期:可有運動活動,基本無增殖, 少見分裂相,影響因素： 滯留期的長短與： 細胞種類、 按種的細胞密度、 培養(yǎng)條件等因素有關。,1.細胞密度 接種分散細胞,接種的密度越大、數量越多，細胞群體越容易適應體外環(huán)境，潛伏

12、期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內，如接種的細胞數量不夠大，潛伏期仍會較長 2.細胞類型 傳代培養(yǎng)的細胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細胞短。 傳代培養(yǎng)期的細胞,一般為6-24h;原代24-96h或更長 單個細胞快,細胞大團慢,組織塊慢 連續(xù)細胞系與發(fā)生惡性轉化的細胞(6-24h)比有限細胞系 與正常二倍體細胞的短 來源：胚胎組織:短,2天可見細胞生長 成體:長,3.細胞機能狀態(tài) 不良者慢 4.培養(yǎng)條件 培養(yǎng)液,pH,底物 不利:污染,有毒,2指數增生期（Logarithmic growth Phase）： 這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否

13、的一個重要標志。一般以細胞分裂指數（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介于0.1%0.5%，初代細胞分裂指數低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%5%。,在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續(xù)35天后，隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。 細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營

14、養(yǎng)成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。,特點： 是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段 培養(yǎng)物中細胞數量呈指數增長,細胞群體均一 是理想的實驗用細胞,判斷細胞生長的指標： 指數生長期內細胞分裂活動的程度(增殖活性)可作為判斷細胞生長是否旺盛的重要指標 1.有絲分裂指數(MI): 指培養(yǎng)物中分裂相數量占全部細胞數量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數1000個細胞。 一般細胞的MI約為0.10.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞高，可達3%5%。,判斷細胞生長的指標： 2.細胞群體倍增

15、時間: 培養(yǎng)物中細胞數量翻倍的平均時間 3.MTT法：反映細胞內一種酶活性程度 4.標記核苷酸(3H-TdR)摻入量：反映DNA,細胞生長一定階段(指數生長期一般持續(xù)35 d）,即可 長滿培養(yǎng)器皿，相互匯合成片(鋪滿 confluence) 當細胞相互接觸連接成片，出現接觸抑制，接觸抑制以后，雖然運動受抑制，但只要營養(yǎng)成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有當細胞密度增大到一定程度，細胞便不再分裂增殖。為密度依賴性細胞生長抑制 當細胞分裂停止后，細胞數量即不再增加進入平臺期,3停滯期（Stagnate Phase）： 細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平臺

16、期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。,概述 細胞鋪滿后再1-2倍增, 進入細胞達飽和密度, 可存活仍有代謝活動，但基本不分裂， 細胞數量維持在某一水平上，生長活動停滯,特點 (1)細胞數量： 細胞達飽和密度，出現密度抑制。 停止生長原因: 細胞數量多、

17、生長地區(qū)占滿、營養(yǎng)消耗、培養(yǎng)液中代謝廢物積聚漸多，細胞停止生長。 即使經常更換培養(yǎng)液，細胞也會變性,從生長基質表面脫落、死亡唯有進行傳代方可緩解。,(2)細胞活動小, 細胞膜的 活動小 (3)生長組分下降: 010% (4)及時傳代：細胞已中毒，即使傳代，也會影響下一代細胞的功能狀況,?,體內細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。,體外培養(yǎng)細胞的種類,（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直

18、接從體內取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。,（二）細胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（Infinite Cell Line）。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質上已是發(fā)生轉化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說

19、明已惡性化。,（三）細胞株 從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）,（四）二倍體細胞 細胞群染色體數目具有與原供體二倍細胞染色體數相同或基本相同（2n細胞占75或80以上）的細胞群，稱二倍體細胞培養(yǎng)。如僅數目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不同，二倍體細胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細胞可傳50代土10代，人胚腎只有810代，人胚神經膠質細胞1530代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或25代即大量凍存作為原種（Stook Cells），用時再進行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細胞的衰老。,（五）遺傳缺陷細胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要