動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)三 魚(yú)類血液涂片制作與血細(xì)胞計(jì)數(shù)

1、.,實(shí)驗(yàn)三 魚(yú)類血液涂片制作與血細(xì)胞計(jì)數(shù),血液：是一種由血漿和血細(xì)胞組成的流體組織，由心臟搏動(dòng)推動(dòng)在心血管系統(tǒng)中不斷循環(huán)流動(dòng)，具有運(yùn)輸、防御和免疫、維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定和參與體液調(diào)節(jié)等多種功能。,.,血液具有維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用，正常情況下血液中的的各項(xiàng)生理指標(biāo)處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，同時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)也能夠反映一個(gè)生物個(gè)體的健康程度，因而血液檢測(cè)已成為疾病檢測(cè)最基本的技術(shù)。,多種多樣的血液檢測(cè)儀,.,血液檢測(cè)能夠輔助疾病診斷,.,血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，也是生物顯微制片的基本方法之一，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對(duì)于各種血液病的診斷具有重要的價(jià)值。制備厚薄適宜，分布均勻，染色良

2、好的血涂片是血液學(xué)檢查的重要基本技術(shù)。,人體血液涂片,.,血液涂片技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物疾病檢測(cè)過(guò)程中也有非常重要的作用，比如細(xì)菌感染、病毒感染以及血液寄生蟲(chóng)疾病的檢測(cè)。目前該技術(shù)已成為水產(chǎn)技術(shù)從業(yè)人員的必備技能，也是執(zhí)業(yè)資格考試的重點(diǎn)內(nèi)容。,.,.,.,涂片經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色液染色后，相應(yīng)各類細(xì)胞呈現(xiàn)不同的著色，從而達(dá)到辨別其形態(tài)特征的目的。一般細(xì)胞的細(xì)胞核嗜堿性，能被堿性燃料染成藍(lán)色，而細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)嗜酸性，能被酸性燃料染成紅色。,.,血細(xì)胞計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品血液的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱細(xì)胞計(jì)數(shù)板），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，根據(jù)血液稀釋的倍數(shù)，進(jìn)一步推算出血液中血細(xì)胞數(shù)

3、的一種方法。,.,.,.,.,魚(yú)類麻醉前后對(duì)比示意圖,.,2、血液的采集 將準(zhǔn)備好的2mL注射器，抽動(dòng)活塞用肝素鈉溶液將注射器內(nèi)濕潤(rùn)，為血液的采集做好準(zhǔn)備工作。血液的采集按實(shí)驗(yàn)2的采血方法進(jìn)行，采好的血液保存于1.5 mL離心管中待用。,.,3、推片 取一塊邊緣光滑的載片做推片。將其一端刮取血滴，迅速使血液均勻分散在推片與載片的接觸處。然后使推片與載片呈3040，向另一端平穩(wěn)地推出，涂片推好后，放置于空氣中使之自然干燥。 （1）將采出的血液滴在載片上,.,（2）另一張邊緣光滑的雙凹片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動(dòng)輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開(kāi)成線狀。,.,（3）兩玻片的角度以30-45為宜

4、，輕輕將雙凹片向前勻速推進(jìn)，即涂成血液薄膜。,.,（4）血涂片,.,不良血涂片,.,4、血涂片染色 先將干燥血片用甲醇固定3-5分鐘，將固定的血片置于被pH 6.4-6.8磷酸鹽緩沖液稀釋10-20倍的吉姆薩染液中，浸染5分鐘（標(biāo)本較少可用滴染法），取出用蒸餾水沖洗，再用伊紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水沖洗，待干后鏡檢。,.,沖洗后滴加少量伊紅，染色1分鐘,直接流水沖洗1分鐘 （切勿先倒掉染液）,涂片經(jīng)水洗干燥后鏡檢,涂片干燥后加吉姆薩染液染色5分鐘,.,二、血細(xì)胞計(jì)數(shù),血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu) XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25個(gè)中格。0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm

5、2表示計(jì)數(shù)室面積是1mm2 ，分為400個(gè)小格，每小格面積是1/400mm2。,.,.,1、血液稀釋 用10微升移液槍取10微升血液于一新的1.5mL離心管中，再用1000微升移液槍吸990微升生理鹽水于離心管中（稀釋100倍），輕輕顛倒混勻。 2、計(jì)數(shù)板處理 用無(wú)水乙醇或95%乙醇溶液擦拭計(jì)數(shù)板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計(jì)數(shù)板上面。 3、充液 取干凈的計(jì)數(shù)板平放于實(shí)驗(yàn)桌上，將蓋玻片置入計(jì)數(shù)板正中央。用毛細(xì)血管吸取已稀釋混勻后的血細(xì)胞懸浮液，并將管尖輕輕斜置于蓋玻片邊緣，讓血細(xì)胞懸液緩慢流出，借毛細(xì)管現(xiàn)象而自動(dòng)流入計(jì)數(shù)室內(nèi)。,.,.,4、靜置 血細(xì)胞懸液充入計(jì)數(shù)室后，靜置23

6、分鐘，待細(xì)胞不再浮動(dòng)后，于低倍鏡下觀察計(jì)數(shù)室內(nèi)待計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分布是否均勻，分布均勻者，方可計(jì)數(shù)。,.,5、按圖計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大方格（每個(gè)大方格又分16個(gè)小方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在一個(gè)大方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計(jì)下線細(xì)胞不計(jì)上線細(xì)胞，計(jì)左線細(xì)胞不計(jì)右線細(xì)胞。,.,6、計(jì)算 計(jì)完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為0.01 cm2，高為0.01 cm，這樣它的體積為0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml1000 mm3，所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)10000細(xì)胞數(shù)/ml，故可按下式計(jì)算： 細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/410 000 如計(jì)數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。,.,血細(xì)胞計(jì)數(shù)換算公式： 1625：計(jì)數(shù)個(gè)數(shù)40010000100稀釋倍數(shù) （單位：個(gè)/ml） 2516：計(jì)數(shù)個(gè)數(shù)4001000080稀釋倍數(shù) （單位：個(gè)/ml）,.,.,4移液槍的使用要按規(guī)定使用，使用時(shí)不要過(guò)力按壓移液槍，用完后要將量程回到移液槍的最大量程處。 5鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，若方格中細(xì)胞分布明顯不均，說(shuō)明