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文檔簡(jiǎn)介
1、、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)技術(shù)、首都醫(yī)科高等院校2015.11、片計(jì)程儀、一、概況二、細(xì)胞球劃痕實(shí)驗(yàn)三、Transwell四、裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)五、總結(jié)一、概況、二、細(xì)胞球劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞球劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法,實(shí)驗(yàn)成本低實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn):1.在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞球的遷移過(guò)程。 2 .適用于研究細(xì)胞球與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM )、細(xì)胞球與細(xì)胞球相互作用的細(xì)胞球遷移。 3 .與包括活生生的細(xì)胞球影像學(xué)的顯微鏡系統(tǒng)兼容,并且可用于分析細(xì)胞球之間的相互作用。 4 .研究細(xì)胞球遷移的體外實(shí)驗(yàn)中最簡(jiǎn)單的方法。 二、細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)材料:細(xì)胞球樣品儀器,易耗品: 6孔大板塊標(biāo)記直尺槍頭試劑,
2、試劑盒:無(wú)血清培養(yǎng)基,PBS,二,細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn),1 .可滅菌儀器均須滅菌2 .超潔凈工作臺(tái)紫外線消毒30min注:需滅菌器材為離心管,吸管移液槍,槍頭,二,細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn)4 .每孔放入5X105個(gè)細(xì)胞球,約2.4時(shí)間的注:1.數(shù)可以通過(guò)晚上貼壁鋪滿,可以適當(dāng)調(diào)整。 數(shù)量少時(shí),可以從一定時(shí)間培養(yǎng)到鋪滿板床。 (3. 6板床背面畫線5-6條),2、細(xì)胞球損傷實(shí)驗(yàn),用5.1ml槍口對(duì)板床和線垂直造成細(xì)胞球損傷,盡可能各損傷寬度一致注:用人造槍口制傷影響難以保證損傷寬度一致性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這也是該方法最大的缺陷,二、三6 .吸取舊培養(yǎng)基,用無(wú)菌PBS洗滌3次細(xì)胞球,除去提取的細(xì)胞球后,加入
3、無(wú)血清培養(yǎng)基,根據(jù)需要設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。 注:清洗時(shí)輕柔、貼壁加入,不流單層細(xì)胞球,二、放入細(xì)胞球劃傷實(shí)驗(yàn)、7.37度5%CO2孵化機(jī)中培養(yǎng)。 0(6)、1.2、2.4時(shí)間采樣、拍攝攝影圖片。 image J軟件的計(jì)算、比較、各分析視野的齒輪離合器面積、二、細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn)、新:德意志IBIDI技術(shù)、1 .細(xì)胞球的準(zhǔn)備、培養(yǎng)液、culture Insert。 在Dish之間的Insert中接種、培養(yǎng)細(xì)胞球。 3 .當(dāng)細(xì)胞球長(zhǎng)度填滿插入?yún)^(qū)域時(shí),用大頭針定徑套去除插入,會(huì)造成500m寬的傷痕。 4 .每隔46小時(shí)拍一次記錄。 5 .根據(jù)收集的圖像數(shù)據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了化學(xué)基分析,結(jié)果表明:二、
4、細(xì)胞球的齒輪離合器實(shí)驗(yàn),闡述了幾個(gè)問(wèn)題:1.細(xì)胞球的選擇:一般適用于上皮,纖維狀細(xì)胞系a .本身具有移動(dòng)能力,且較強(qiáng)。 b .有極性,易于測(cè)量、觀察。 c .對(duì)無(wú)血清有很強(qiáng)的忍耐力。 2 .觀察時(shí)間:一般為0,6,1.2,2.4時(shí)間a .時(shí)間長(zhǎng),無(wú)血清,易死亡,較強(qiáng)b .時(shí)間長(zhǎng),細(xì)胞球繁殖,假陽(yáng)性,二,細(xì)胞球搔爬實(shí)驗(yàn),三,Transwell,Transwell應(yīng)用Transwell細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞球共培養(yǎng),細(xì)胞球趨化三、Transwell、Transwell池:常用8.0um膜、黏附130rmb、黏附40rmb,上層培養(yǎng)液:無(wú)血清培養(yǎng)基,為了維持滲透壓,應(yīng)添加0.05%-0.2% BSA細(xì)胞球:侵
5、襲性細(xì)胞球去血后充饑1224h 材料準(zhǔn)備和說(shuō)明三、Transwell、基質(zhì)糊:底膜材料Matrigel的下層培養(yǎng)液:含有5% FBS的培養(yǎng)基,趨化因子細(xì)胞球培養(yǎng)板: 6孔,1.2孔,2.4孔等,在2.4孔中最常用,材料準(zhǔn)備和說(shuō)明:三1 .用Transwell池制備涂層基底膜:用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液涂層Transwell池底部膜的上室面,4風(fēng)干水化基底膜:吸引培養(yǎng)板中的剩馀液體,每孔含有50ul10g/lbsa的無(wú)血清三、Transwell、二.取細(xì)胞球混懸劑裝入Transwell單元,2.4小孔單元一般為200l。 一般在細(xì)胞球密度為110105個(gè)的. 3.24孔的下室中
6、裝入含有FBS和趨化因子的培養(yǎng)基500l。三、細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn),4 .培養(yǎng)細(xì)胞球:常規(guī)培養(yǎng)48h,具體調(diào)整,5 .結(jié)果測(cè)定:直接測(cè)定:細(xì)胞球染色,鏡下計(jì)數(shù)間接測(cè)定: MTT法,熒光試劑檢測(cè),結(jié)晶紫染色,提問(wèn):某些藥物能抑制細(xì)胞球侵襲,抑制2.4時(shí)間后細(xì)胞球增殖,培養(yǎng)36h能看到結(jié)果嗎? 三、Transwell,直接觀察:用棉棒拂拭基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞球染色:推薦0.1%結(jié)晶紫固定染色。 細(xì)胞球數(shù):反復(fù)直接觀察細(xì)胞,或切開膜直接染色,取幾個(gè)視野來(lái)計(jì)算細(xì)胞球數(shù)。 三、Transwell,間接觀察:結(jié)晶紫法用棉棒拂拭基質(zhì)糨糊和上室內(nèi)的細(xì)胞球染色:推薦0.1%結(jié)晶紫固定染色。 染色后,以33%冰乙
7、酸脫色,可完全溶出結(jié)晶紫,洗脫劑以酶標(biāo)儀570nm測(cè)定ODD值,間接反映細(xì)胞球數(shù)。 四、裸鼠尾靜脈注射,小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型分類:1.人工轉(zhuǎn)移模型:注射腫瘤細(xì)胞球體外培養(yǎng)株和腹水等,并在肺(尾靜脈注射)、腦(頸動(dòng)脈注射)肝臟(肝動(dòng)脈注射)等處觀察2 .自發(fā)轉(zhuǎn)移模型:腫瘤細(xì)胞球接種小鼠腋下和腳丫子指皮下、腹腔肌和原組織,并觀察轉(zhuǎn)移灶四、裸鼠尾靜脈注射,1 .裸鼠選擇:4-6周裸鼠,價(jià)格約100 rmb 2.細(xì)胞球選擇:查閱文獻(xiàn),選擇合適的細(xì)胞球株細(xì)胞球濃度:具體不定,動(dòng)物腫瘤一般接種2600萬(wàn)100%的腫瘤,而人癌高1000萬(wàn)以上裸鼠尾部靜脈注射,3 .注射技巧:固定: 50ml離心管自制或產(chǎn)品注射位置:小鼠尾部側(cè)面的2條靜脈,一般為尾部前端的1/3至1/2處插針。 注射:選用1-2ml注射器,針采用4號(hào)或4.5號(hào)。 靜脈的強(qiáng)調(diào):溫水、燒燈等,四、裸鼠的尾靜脈注射,判斷是如何注射的:注射到靜脈的液體幾乎沒(méi)有抵抗,可以很快擠壓完液體的通常的600ul可以在1.0秒內(nèi)推一推。 靜脈以外注射,勉強(qiáng)推液阻力大,注射處周圍出現(xiàn)露水樣滲出液,出針后出血少。 另外,藥液淤
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