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文檔簡介
1、、腫瘤侵襲、轉移實驗技術、首都醫(yī)科高等院校2015.11、片計程儀、一、概況二、細胞球劃痕實驗三、Transwell四、裸鼠尾靜脈注射實驗五、總結一、概況、二、細胞球劃痕實驗、細胞球劃痕實驗是一種簡單檢測細胞運動的方法,實驗成本低實驗的優(yōu)點:1.在一定程度上模擬了體內細胞球的遷移過程。 2 .適用于研究細胞球與細胞外基質(ECM )、細胞球與細胞球相互作用的細胞球遷移。 3 .與包括活生生的細胞球影像學的顯微鏡系統(tǒng)兼容,并且可用于分析細胞球之間的相互作用。 4 .研究細胞球遷移的體外實驗中最簡單的方法。 二、細胞球齒輪離合器實驗,實驗材料:細胞球樣品儀器,易耗品: 6孔大板塊標記直尺槍頭試劑,
2、試劑盒:無血清培養(yǎng)基,PBS,二,細胞球齒輪離合器實驗,1 .可滅菌儀器均須滅菌2 .超潔凈工作臺紫外線消毒30min注:需滅菌器材為離心管,吸管移液槍,槍頭,二,細胞球齒輪離合器實驗4 .每孔放入5X105個細胞球,約2.4時間的注:1.數(shù)可以通過晚上貼壁鋪滿,可以適當調整。 數(shù)量少時,可以從一定時間培養(yǎng)到鋪滿板床。 (3. 6板床背面畫線5-6條),2、細胞球損傷實驗,用5.1ml槍口對板床和線垂直造成細胞球損傷,盡可能各損傷寬度一致注:用人造槍口制傷影響難以保證損傷寬度一致性的實驗結果,這也是該方法最大的缺陷,二、三6 .吸取舊培養(yǎng)基,用無菌PBS洗滌3次細胞球,除去提取的細胞球后,加入
3、無血清培養(yǎng)基,根據需要設置實驗組、對照組。 注:清洗時輕柔、貼壁加入,不流單層細胞球,二、放入細胞球劃傷實驗、7.37度5%CO2孵化機中培養(yǎng)。 0(6)、1.2、2.4時間采樣、拍攝攝影圖片。 image J軟件的計算、比較、各分析視野的齒輪離合器面積、二、細胞球齒輪離合器實驗、新:德意志IBIDI技術、1 .細胞球的準備、培養(yǎng)液、culture Insert。 在Dish之間的Insert中接種、培養(yǎng)細胞球。 3 .當細胞球長度填滿插入區(qū)域時,用大頭針定徑套去除插入,會造成500m寬的傷痕。 4 .每隔46小時拍一次記錄。 5 .根據收集的圖像數(shù)據對實驗結果進行了化學基分析,結果表明:二、
4、細胞球的齒輪離合器實驗,闡述了幾個問題:1.細胞球的選擇:一般適用于上皮,纖維狀細胞系a .本身具有移動能力,且較強。 b .有極性,易于測量、觀察。 c .對無血清有很強的忍耐力。 2 .觀察時間:一般為0,6,1.2,2.4時間a .時間長,無血清,易死亡,較強b .時間長,細胞球繁殖,假陽性,二,細胞球搔爬實驗,三,Transwell,Transwell應用Transwell細胞進行細胞球共培養(yǎng),細胞球趨化三、Transwell、Transwell池:常用8.0um膜、黏附130rmb、黏附40rmb,上層培養(yǎng)液:無血清培養(yǎng)基,為了維持滲透壓,應添加0.05%-0.2% BSA細胞球:侵
5、襲性細胞球去血后充饑1224h 材料準備和說明三、Transwell、基質糊:底膜材料Matrigel的下層培養(yǎng)液:含有5% FBS的培養(yǎng)基,趨化因子細胞球培養(yǎng)板: 6孔,1.2孔,2.4孔等,在2.4孔中最常用,材料準備和說明:三1 .用Transwell池制備涂層基底膜:用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液涂層Transwell池底部膜的上室面,4風干水化基底膜:吸引培養(yǎng)板中的剩馀液體,每孔含有50ul10g/lbsa的無血清三、Transwell、二.取細胞球混懸劑裝入Transwell單元,2.4小孔單元一般為200l。 一般在細胞球密度為110105個的. 3.24孔的下室中
6、裝入含有FBS和趨化因子的培養(yǎng)基500l。三、細胞球齒輪離合器實驗,4 .培養(yǎng)細胞球:常規(guī)培養(yǎng)48h,具體調整,5 .結果測定:直接測定:細胞球染色,鏡下計數(shù)間接測定: MTT法,熒光試劑檢測,結晶紫染色,提問:某些藥物能抑制細胞球侵襲,抑制2.4時間后細胞球增殖,培養(yǎng)36h能看到結果嗎? 三、Transwell,直接觀察:用棉棒拂拭基質膠和上室內的細胞球染色:推薦0.1%結晶紫固定染色。 細胞球數(shù):反復直接觀察細胞,或切開膜直接染色,取幾個視野來計算細胞球數(shù)。 三、Transwell,間接觀察:結晶紫法用棉棒拂拭基質糨糊和上室內的細胞球染色:推薦0.1%結晶紫固定染色。 染色后,以33%冰乙
7、酸脫色,可完全溶出結晶紫,洗脫劑以酶標儀570nm測定ODD值,間接反映細胞球數(shù)。 四、裸鼠尾靜脈注射,小鼠腫瘤轉移模型分類:1.人工轉移模型:注射腫瘤細胞球體外培養(yǎng)株和腹水等,并在肺(尾靜脈注射)、腦(頸動脈注射)肝臟(肝動脈注射)等處觀察2 .自發(fā)轉移模型:腫瘤細胞球接種小鼠腋下和腳丫子指皮下、腹腔肌和原組織,并觀察轉移灶四、裸鼠尾靜脈注射,1 .裸鼠選擇:4-6周裸鼠,價格約100 rmb 2.細胞球選擇:查閱文獻,選擇合適的細胞球株細胞球濃度:具體不定,動物腫瘤一般接種2600萬100%的腫瘤,而人癌高1000萬以上裸鼠尾部靜脈注射,3 .注射技巧:固定: 50ml離心管自制或產品注射位置:小鼠尾部側面的2條靜脈,一般為尾部前端的1/3至1/2處插針。 注射:選用1-2ml注射器,針采用4號或4.5號。 靜脈的強調:溫水、燒燈等,四、裸鼠的尾靜脈注射,判斷是如何注射的:注射到靜脈的液體幾乎沒有抵抗,可以很快擠壓完液體的通常的600ul可以在1.0秒內推一推。 靜脈以外注射,勉強推液阻力大,注射處周圍出現(xiàn)露水樣滲出液,出針后出血少。 另外,藥液淤
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