基因工程專題1-5.ppt

1、4.目的基因的檢測(cè)與鑒定：目的基因在受體細(xì)胞中是否穩(wěn)定存在，是否表達(dá)? （1）分子水平的鑒定： 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入目的基因-目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵；檢測(cè)方法？ 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 檢測(cè)方法？ 檢測(cè)目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì) 檢測(cè)方法？ （2）個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定 方法？,核酸探針：核酸探針是指帶有放射性同位素(如32P)、熒光分子等標(biāo)記的特定已知序列的核酸片段，它能和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測(cè)核酸樣品中特定基因序列的檢測(cè)。包括DNA探針和RNA探針。 核酸探針具有特異性，高度的敏感性。 核酸分子雜交：互補(bǔ)的核苷酸序列通過堿

2、基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程稱為核酸分子雜交。,完,把某一生物體內(nèi)全部已知基因分別點(diǎn)到DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)情況。,(1)斑點(diǎn)印跡(Dot-blot)將待測(cè)核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣在膜上，稱之為斑點(diǎn)印跡。為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點(diǎn)樣后的膜進(jìn)行80真空烘烤2h。 (2)Southern印跡(Southern blot)這是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 (3) Northern印跡(Northern blot)Northern印跡是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固

3、相支持物上的過程。 雜交的雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測(cè)的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交, 即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測(cè)。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法,例如，使用熒光分子。,固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個(gè)基本過程：第一，通過印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交；第三，雜交信號(hào)的檢測(cè)。 用探針對(duì)細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交并進(jìn)行檢測(cè)的方法稱之為核酸原位雜

4、交。某特點(diǎn)是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進(jìn)入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)。例如?？捎锰禺愋缘募?xì)菌、病毒的核酸做為探針對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應(yīng)用上有獨(dú)特的意義。 2.雜交反應(yīng)的基本過程雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和漂洗幾步操作。 預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物(Denharts溶液)將待測(cè)核酸分子中的非特異性位點(diǎn)封閉，以避免這些位點(diǎn)與探針的非特異性結(jié)合。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測(cè)核酸單鏈在一定溫度和條件下進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)的過程。雜交反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)進(jìn)行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標(biāo)記探針，以避免干擾特異性雜交信號(hào)的檢測(cè)。膜洗凈后,將繼續(xù)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。,基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，可以用圖11-5-1來說明。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCA