菊花的組織培養(yǎng)

1、課題1 菊花的組織培養(yǎng),菊 花 的 品 種 繁 多,菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物,是我國的傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一。 長期以來菊花采用分株、扦插等無性繁殖方法進行繁殖。但是傳統(tǒng)的繁殖方法易受環(huán)境影響,繁殖周期長,隨著市場需求的急劇增加,已經不能滿足市場日益發(fā)展的需要。,植物組織培養(yǎng)屬于無性生殖中營養(yǎng)生殖 營養(yǎng)生殖包括：,扦插,嫁接,壓條,植物組織培養(yǎng)：,當植物細胞脫離了原來所在植物體的器官或組織而處于離體狀態(tài)時，在一定的營養(yǎng)物質、激素（細胞分裂素、生長素）和其他外界條件（溫度、pH、光照、無菌等）的作用下，就可能表現出全能性，發(fā)育成完整的植株，這種培育新植株的方法，叫做植物的組織培養(yǎng)。

2、,20世紀初，曾有人提出能否將植物的薄壁細胞培養(yǎng)成完整植株？研究者從胡蘿卜根的韌皮部取下一塊組織，并在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其分化出了愈傷組織，從愈傷組織又得到胚狀體，胚狀體轉移到固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)后，獲得了完整的胡蘿卜試管植株。經過栽培，此植株能夠正常生長并開花結果，其種子繁衍出來的后代與正常植株的種子所繁衍出的后代別無二致。根據此實驗可以得出以下結論：即不經過有性生殖過程也能將植物的薄壁細胞培養(yǎng)出與母體一樣的完整植株。由于植物的每個有核細胞都攜帶著母體的全部基因，故在一定條件下，它們均能發(fā)育成完整植株，這就是所謂的植物細胞全能性。,植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡史,科學家在植物激素對器官建成，及改進培

3、養(yǎng)基配方等方面所取得的成果，極大地推動了組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，使這項技術可以實際應用于快速繁殖、品種改良等方面。20世紀50年代初期，法國科學家利用組織培養(yǎng)技術成功地脫除了染病大麗花植株所攜帶的病毒，從而為脫毒苗的生產提供了一種可行的途徑?，F在憑借組織培養(yǎng)技術來脫除植物的病毒已經在生產中廣泛應用。20世紀50年代中期，由于細胞分裂素的發(fā)現，使組織培養(yǎng)狀態(tài)下外植體芽的形態(tài)建成成為可人為調控的因素，從而使在組織培養(yǎng)狀況下進行植株再生成為現實。進入60年代以后，組織培養(yǎng)技術在基礎理論、實際操作方面不斷取得進展，相繼在植物體細胞雜交、單倍體育種、種質資源保存、快速育苗、人工種子制造、次生代謝物生產等方面

4、有了可喜的成果。時至今日，組織培養(yǎng)技術已經成為基礎堅實、易于掌握、應用面廣的一種技術手段。,（一）植物組織培養(yǎng)的 理論基礎,概念：高度分化的植物細胞，仍然具有發(fā)育成 完整新個體的潛能。 基礎：生物體的每一個細胞都包含有該物種所 特有全套遺傳物質，都有發(fā)育成為完整 個體所必需的全部基因。因為它們都是 由同一個受精卵細胞有絲分裂分化而來。,基礎知識：,細胞全能性,細胞全能性的特點： 高度分化的植物細胞在離體的情況下，在一定的營養(yǎng)物質、激素和其他適宜的外界條件下，才能表現其全能性。 動物已分化的體細胞全能性受限制，但細胞核仍具有全能性,植物細胞要表現全能性，步驟： 1.成熟細胞 分生細胞 胚狀體 完

5、整植株 2.成熟細胞 愈傷組織 出根出芽完整植株,需要條件： 1.離體 2.一定的營養(yǎng)物質 3.植物激素：主要是生長素和細胞分裂素 4.適宜溫度和pH,細胞全能性大?。?受精卵生殖細胞體細胞 植物細胞動物細胞 分化程度低的細胞分化程度高的細胞,植物組織培養(yǎng)過程：,離體的植物器官 組織或細胞,植物體,脫分化 （細胞分裂）,愈傷組織,芽,根,細胞分裂素生長素,細胞分裂素生長素,再分化,植物組織培養(yǎng),不需要光,需要光,（細胞分化）,脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫（去）分化 。,離體的植物組織或細胞，在培養(yǎng)了一段時間后，會通過細胞分裂，形成愈傷組織。,方式

6、：有絲分裂,脫分化就是有絲分裂的過程。,愈傷組織：由離體的植物器官、組織或細胞，通 過細胞分裂形成的細胞團，叫做愈傷 組織。 特點：細胞排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化；呈 無定形狀態(tài)的薄壁細胞。,再分化：由脫分化產生的愈傷組織重新分化形成根或芽等器官的過程，叫做再分化。,再分化就是細胞分化過程。,細胞分化,細胞分化：在植物的個體發(fā)育過程中，細胞在形態(tài)、結構和生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程，叫做細胞分化。 細胞分化的特點： 持久性:細胞分化貫穿于生物體整個生命進程中,在胚胎期達到最大限度 穩(wěn)定性和不可逆性:一般來說,分化了的細胞將一直保持分化后的狀態(tài),直到死亡 普遍性:生物界普遍存在,是生物個體發(fā)

7、育的基礎,細胞分化的實質: 在個體發(fā)育過程中，不同細胞中遺傳信息的執(zhí)行情況不同，即基因的選擇性表達 細胞分化的結果： 在空間上細胞之間出現差異，在時間上同一細胞和它以前的狀態(tài)有所不同。 最終形成新的個體,細胞分化的意義： 生物個體發(fā)育的基礎；細胞分化使多細胞生物體中的細胞趨向專門化，有利于提高各種生理功能的效率。,（1）不同的植物，培養(yǎng)的難易程度差別很大：,煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易；,枸杞愈傷組織的芽誘導比較難；,（2）同一種植物材料的年齡、保存時間的長 短等也會影響實驗結果。,菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側枝。,（二）影響植物組織培養(yǎng)的因素：,1植物材料的影響：,主

8、要是大量元素和微量元素的影響。,無機營養(yǎng)的影響：,A大量元素: N、P、 K、 Ca、Mg 、 S等；,B微量元素: B、Mn、Cu、Zn、 Fe、Mo、I、Co等,其中： 、主要影響蛋白質、核酸的合成； K、 Ca、Mg、S主要影響酶的活性。,主要是甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖的影響。,3有機營養(yǎng)的影響：,其中： 蔗糖既是碳源也是調節(jié)滲透壓的物質； 維生素能促進細胞分裂和誘導器官分化； 甘氨酸是蛋白質的組成成分，也是有機氮源。,4溫度、光照、pH的影響：,光照： 菊花每日用日光燈照射12h。,溫度： 大多數植物組織培養(yǎng)控制在2327， 低于15時植物組織會表現生長停止； 高于35時對植物

9、生長不利。 菊花的組織培養(yǎng)控制在1822。,pH： 不同植物對培養(yǎng)基最適pH的要求不 同，大多數控制在56.5。 菊花的組織培養(yǎng)控制在5.8左右。,常用的植物激素： 生長素、細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵性激素。 在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈加強的趨勢。 激素的使用順序、使用量及比例影響植物細胞的發(fā)育方向。,5植物激素的影響：,生長素、細胞分裂素和 赤霉素。,生長素類：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。,細胞分裂素類：,激動素（KT）、6芐基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）等。,赤霉素類：,赤霉酸（GA3）

10、等,作用：2，4D有利于愈傷組織的生長； IAA、NAA、IBA有利于器官分化。,作用：促進細胞的分裂與分化，其中KT能 明顯促進芽的分化而抑制根的形成。,作用：促進不定芽和幼株伸長。,有利于根的分化，抑制芽的形成,有利于芽的分化，抑制根的形成,促進愈傷組織的形成,激素的使用順序、使用量及比例影響植物細胞的發(fā)育方向：,先使用生長素，后使用細胞分裂素,有利于細胞分裂，但不利分化,先使用細胞分裂素，后使用生長素,同時使用,細胞既分裂也分化,分化頻率提高,菊花的組織培養(yǎng)程序：,制備MS固體培養(yǎng)基,實驗流程圖：,課外拓展,MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細胞培養(yǎng)設計的，其特

11、點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數量和比例合適，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。 基于此，這種培養(yǎng)基就用他們的名字來命名了。,MS培養(yǎng)基主要成分：,大量元素: N、P、 K、 Ca、 S 、 Mg等,微量元素: B、Mn、Cu、Zn、 Fe、Mo、I、Co等,有機物：甘氨酸、煙酸、肌醇、 維生素、蔗糖等,植物激素：生長素、細胞分裂素、 赤霉素等,微生物培養(yǎng)基的配方和MS培養(yǎng)基的配方相比，有哪些明顯的不同？,微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同， MS培養(yǎng)基則需提供大量無

12、機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。,（一）制備MS固體培養(yǎng)基：,MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實驗室一般使用4保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備。,1配制各種母液：,無機物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮 100倍，常溫保存。,激素類、維生素類以及用量較小的有機物一 般可按1mg/mL的質量濃度單獨配制成母液。,用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據各種母液的 濃縮倍數，計算用量。,實驗操作,2配制培養(yǎng)基：,分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50mL或100mL。, 配制培養(yǎng)液：配制1LMS培養(yǎng)基時，先將稱好的瓊 脂加入800mL蒸餾水，加熱使瓊脂熔化，然后加入 蔗糖30g，取配制好的

13、大量元素、微量元素、有機 物和植物激素的母液，依次加入，加蒸餾水定容 至1000mL。, 調pH：,培養(yǎng)基的分裝:,由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因 此不必添加植物激素。,3滅菌：,將分裝好的培養(yǎng)基連同其他 器械一起進行高壓蒸汽滅菌。,1選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝。,（二）外植體消毒：,2消毒：, 流水沖洗：,菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。, 酒精處理：,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數為70的酒精中搖動23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗。, 消毒液處理：,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放

14、入質量分數為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后，在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液。,(外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。),（三）接種：,接種前用體積分數為70的酒精將工作臺擦拭一遍，然后點燃酒精燈。因為污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子。,1接種室消毒：,2無菌操作要求：,所有的接種操作都必須在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌。,3材料的切取和接種：,將消過毒的菊花莖段在無菌培養(yǎng)皿中切成0.51cm的小段，用鑷子夾取菊花莖段接種。,4接種注意事項：, 每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分數為 70的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火 焰上燒一遍，冷卻后再接

15、種。, 外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植 體數量根據錐形瓶的大小確定，一般胡蘿 卜34塊，菊花68塊，也不要太少，以 充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件。, 插入時應注意莖段方向，形態(tài)學上端朝上， 形態(tài)學下端朝下，不要倒插。莖段、莖尖 基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分。,（四）培養(yǎng)：,接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應定期消毒。培養(yǎng)溫度控制在1822。 每日用日光燈光照12h。,（五）移栽：,1打開封口膜： 移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日。一般放置在2025的遮蔭環(huán)境中，適應57d。試管苗不萎蔫，有新生長的趨勢，便可移栽。,2清洗轉

16、移：,用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間。,3移栽：,待幼苗長壯后再移栽到土壤中。,珍珠巖： 珍珠巖是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經急劇冷卻而成的玻璃質巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結構，所以被命名為珍珠巖 。,蛭石： 是一種天然、無毒的礦物質，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。,（六）栽培：,將幼苗移栽后，每天觀察記錄幼苗生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。,1、培養(yǎng)基的配置。要根據不同的材料，不同的物種，選擇合適的培養(yǎng)基，最好有一組實驗取得。做培養(yǎng)基的過程中注意調劑培養(yǎng)基的PH值，有些高溫分解的激素要過濾滅菌等。 2、培養(yǎng)

17、材料的選擇，需要選擇生長較好材料,植物組織培養(yǎng)的注意事項：,3 嚴格無菌操作 ，無菌技術是植物組織培養(yǎng)獲得成功關鍵。 1）無菌技術包括對培養(yǎng)基、器械、和植物材料的滅菌消毒。對培養(yǎng)材料進行表面消毒時，一方面要考慮到要藥劑消毒效果，另方面要考慮到植物材料的耐受性。 2）妥善處理被污染培養(yǎng)物。 3）有毒物質要妥善處理，以免造成環(huán)境污染。 外植體可以用酒精消毒；操作前手需用酒精消毒；培養(yǎng)基 需用高壓蒸汽滅菌。,4接種時注意： 1）每接種一塊外植體前，鑷子要放入體積分數為70%的酒精中消毒一次，然后再酒精燈火焰上燒灼一遍，冷卻后再接種。 2）外植體在培養(yǎng)基重要分布均勻，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照

18、條件。 3）插入時應注意方向，不要倒插。莖段 莖尖基部插入培養(yǎng)基有利于吸收水分和養(yǎng)分。 4）接種后幾十個瓶蓋好瓶蓋，做好標記，寫明接種材料，接種日期。 5、培養(yǎng)條件的選擇，包括光照、溫度、濕度等。,植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點：,1.不受生長季節(jié)限制地繁殖植物。 2.不攜帶病毒。 3.培養(yǎng)周期短。 4.可用組培中的愈傷組織制取特殊的生化制品。 5.可短時間大量繁殖，用于拯救瀕危植物。 6.可誘導之分化成需要的器官，如根和芽。 7.解決有些植物產種子少或無的難題。如將香蕉進行組培得到人工種以方便移種。,植物組織培養(yǎng)的用途：,快速繁殖優(yōu)良植物株系 培育作物新品種 獲得無病植株 保存和運輸種質,CNgeli認為在生殖細胞成分中可區(qū)別為二種，其中在雌雄兩生殖細胞中等量存在的為遺傳的基本物質稱