基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工及逆轉(zhuǎn)錄.ppt

1、第十三章 基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工及逆轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄(transcription)： 以DNA單鏈為模板，NTP為原料，在DNA依賴的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過程。 轉(zhuǎn)錄的條件：,模板 原料 酶 產(chǎn)物 配對 方向 引物,DNA(不對稱轉(zhuǎn)錄） NTP RNA聚合酶 mRNA,tRNA,rRNA，小RNA A-U,T-A,G-C 5 3 不需要,轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的異同點(diǎn),幾個(gè)基本概念,結(jié)構(gòu)基因(structure gene) 模板鏈(template strand) Watson(W) 鏈、負(fù)(-)鏈(minus strand)、 反意義鏈(antisense strand) 編碼鏈(coding s

2、trand) Crick(C)鏈、正(+)鏈(plus strand)、 有意義鏈(sense strand) 不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription),結(jié)構(gòu)基因(structure gene)： DNA分子中能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段。,模板鏈：反意義鏈（antisense，(-)鏈） 以該鏈中的DNA堿基順序指導(dǎo)RNA的合成即被轉(zhuǎn)錄的那條DNA鏈。,密碼鏈： 有意義鏈（sense，（+）鏈）不被轉(zhuǎn)錄的那條DNA鏈，但其堿基順序除T代替U外，其余與mRNA相同。,5-GCAGTACATGTC-3編碼鏈 DNA 3-CGTCATGTACAG-5模板鏈 5-GCAGUACAUGU

3、C-3 mRNA N -Ala-Val-His-Val-C 蛋白質(zhì),不對稱轉(zhuǎn)錄 1.DNA雙鏈上，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股不轉(zhuǎn)錄。2.有意義鏈與反意義鏈并非固定不變。3.轉(zhuǎn)錄方向都是5 3,轉(zhuǎn)錄方向5 3,模板鏈,圖13-1,第一節(jié) 參與轉(zhuǎn)錄的酶 RNA聚合酶依賴DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase,DDRP）,以DNA為模板，催化2個(gè)游離的NTP 形成3，5-磷酸二酯鍵,一、原核生物RNA聚合酶,1、大腸埃希菌RNA聚合酶的組成 （1）全酶(holoenzyme) 由4種(5個(gè))亞基2組成 （2）核心酶(core enzyme) 2 ，參與轉(zhuǎn)錄的全過程

4、（3）亞基 亦稱因子（ factor)轉(zhuǎn)錄輔助因子 識(shí)別啟動(dòng)子，不參與轉(zhuǎn)錄過程,全 酶 核 心 酶,亞基 2 ,功能 決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄 結(jié)合底物，形成磷酸二酯鍵（催化） 結(jié)合模板（開鏈） （核心酶參與轉(zhuǎn)錄全過程） 識(shí)別起始點(diǎn)啟動(dòng)子（延長時(shí)脫落）,二、真核生物RNA聚合酶（三種）,類型 ,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 rRNA:18s,5.8s,28s hnRNA tRNA,5srRNA,snRNA,對鵝膏蕈堿 的反應(yīng) 不敏感 高度敏感 不同物種 敏感性不同,第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄過程 (起始、延長、終止),一、轉(zhuǎn)錄的起始 1、原核生物的起始 RNA聚合酶(全酶)與DNA模板(啟動(dòng)子)結(jié)合 結(jié)合過程： 閉和的啟動(dòng)子復(fù)合體

5、開放的啟動(dòng)子復(fù)合體,DNA模板 啟動(dòng)子（promoter）1、概念:轉(zhuǎn)錄開始時(shí)能與RNA全酶結(jié)合的DNA順序（雙鏈）2、原核生物啟動(dòng)子的特點(diǎn):(1)DNA序列在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5端區(qū)(上游區(qū))(2)-10bp處 -TATAAT- (Pribnow box)(3)-35bp處 -TTGACA-,因子 RNA聚合酶中識(shí)別及結(jié)合啟動(dòng)子的亞基，延長時(shí)脫落，不參與轉(zhuǎn)錄過程，是轉(zhuǎn)錄輔助因子。 因子識(shí)別位點(diǎn)：啟動(dòng)子-35區(qū)、-10區(qū),原核生物有多種因子 一般情況下起作用的是-70 70 有四個(gè)保守區(qū)域： 第2區(qū)域、第4區(qū)域和-35區(qū)和-10區(qū)結(jié)合,結(jié)合過程： 閉和的啟動(dòng)子復(fù)合體 RNA聚合酶（全酶）中的因子在D

6、NA雙鏈 上迅速、隨機(jī)滑動(dòng)，尋找到啟動(dòng)子-35區(qū)， 形成疏松的復(fù)合物，DNA雙鏈未解開。 開放的啟動(dòng)子復(fù)合體 RNA聚合酶（全酶）移向-10區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始 點(diǎn)在-20區(qū)DNA雙鏈解開12-17bp時(shí)的啟動(dòng)子 復(fù)合體。,2,5,5,原核生物轉(zhuǎn)錄起始過程,2、真核生物的起始 較原核生物復(fù)雜 順式作用元件 (啟動(dòng)子/增強(qiáng)子) 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF) RNA聚合酶所需的轉(zhuǎn)錄因子 -轉(zhuǎn)錄因子 （TF）,真核生物啟動(dòng)子（1）DNA序列在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5端區(qū)(上游區(qū))（2）-30bp ：TATA盒（Hogness box） （3）-90bp ：GC盒（4）-70bp ：CAA

7、T盒,GC,CAAT,-90,-70,RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄起始,RNA聚合酶催化各種前體mRNA的合成 需要多種TF參與：TFA-J,真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝 啟動(dòng)子TATA盒+ TFD +D-A復(fù)合物(TFD+ TFA) + TFB +(RNA聚合酶+ TFF)復(fù)合物 +TFE 、TFJ +TFH（解旋酶、蛋白激酶） DNA解旋、RNA聚合酶C-端Ser磷酸化 從起始點(diǎn)向下游移動(dòng),TBP-TATA binding protein TAF-TBP-associated factors,二、延長- 轉(zhuǎn)錄泡（1）RNA聚合酶（核心酶）與DNA模板緊密結(jié)合，沿3 5方向移動(dòng)解旋作用：DNA解開

8、17 bp聚合功能（不具外切酶功能） （2）雜交螺旋 RNA-DNA形成12bp長的雜交螺旋 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA沿5 3方向延長 RNA延長速度：50個(gè)核苷酸/秒/每分子酶,核心酶,圖13-7,三. 終止 轉(zhuǎn)錄至模板某一位置 停止形成磷酸二酯鍵 RNADNA雜交鏈解開 DNA解鏈的部分重新形成雙螺旋 RNA聚合酶離開DNA,終止的方式,依賴-因子的終止 -因子的結(jié)構(gòu),六個(gè)亞基組成的 蛋白質(zhì) ATP酶活性 與單鏈RNA結(jié)合,-因子的作用,與新生RNA結(jié)合 ATP供能 -因子沿 新生的RNA單鏈推進(jìn) 新生的RNA單鏈 從DNA模板上分離下來,新生RNA,圖13-8,不依賴-因子的終止 DNA模板上有終

9、止信號(hào) 轉(zhuǎn)錄出來的RNA RNA聚合酶遇此結(jié)構(gòu) 即停止工作。 DNA和RNA（dA：rU） 穩(wěn)定性下降,GC富含和AT富含區(qū)的 回文結(jié)構(gòu) 自身互補(bǔ)形成 發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)（hairpin） 3尾端有4個(gè)U DNA恢復(fù)雙鏈， 釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,發(fā)夾結(jié)構(gòu),環(huán),莖,多個(gè)U,DNA模板 3,5,四.轉(zhuǎn)錄的抑制作用,與DNA模板作用 與RNA聚合酶作用 原核生物 真核生物,放線菌素D-插入dG*dC間 低濃度-(-)RNA延長 高濃度-(-)RNA起始 (-)DNA復(fù)制 利福平/利福霉素 和原核生物RNA聚合酶 亞基結(jié)合-(-)轉(zhuǎn)錄起始 鵝膏蕈堿 -(-)RNA聚合酶,mRNA可直接作為翻譯的模板 rRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)

10、物要加工、修飾 tRNA,第三節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后的加工 一.原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工：,原核生物和真核生物mRNA的不同：,原核生物mRNA 多順反子 轉(zhuǎn)錄與翻譯同步 mRNA不需加工 壽命短,真核生物mRNA 單順反子 轉(zhuǎn)錄后需加工運(yùn)至胞漿 再翻譯 mRNA需加工 壽命較長,1、rRNA的加工,原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄初始物: rRNA基因和tRNA基因混合組成一個(gè)操縱子： 16SrDNA tDNA 23SrDNA 5SrDNA tDNA rRNA轉(zhuǎn)錄初始物: 16SrRNA tRNA 23SrRNA 5SrRNA tRNA 加工 RNA酶對轉(zhuǎn)錄初始物切割 再加工成熟,2、tRNA的加工,原核生

11、物tRNA轉(zhuǎn)錄初始物: tRNA基因: 型- tRNA 有 3-CCA-OH 型- tRNA 無 3-CCA-OH tRNA轉(zhuǎn)錄初始物: 與rRNA相連 幾個(gè)相同(不同)tRNA連在一起,加工,RNA酶 RNA酶D RNA酶P tRNA核苷轉(zhuǎn)移酶,切開rDNA tDNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 間隔序列 核酸外切酶,切除型tRNA 3-CCA-OH下游序列 核糖核蛋白,使tRNA 5端成熟 催化型tRNA形成穩(wěn)定的3-CCA-OH,二.真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工 1、rRNA轉(zhuǎn)錄后的加工,真核生物rRNA的基因 (rDNA) 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,成簇縱列串聯(lián)排列 高度重復(fù)序列DNA 核質(zhì):()-不需加工 5s rRNA

12、 核仁:()-加工 5.8s rRNA 28s rRNA 18s rRNA,rDNA,內(nèi)含子,基因間隔,18s,5.8s,28s,每個(gè)重復(fù)單位,45s 轉(zhuǎn)錄物 3種 rRNA前身,剪接,18srRNA,5.8s/28s rRNA,轉(zhuǎn)錄后的加工和與核糖體的裝配同時(shí)進(jìn)行,前rRNA的切割特點(diǎn)： 在特殊序列位點(diǎn)由核仁小RNA(snoRNA)催化，snoRNA+蛋白質(zhì) 核仁小核蛋白(sno-RNP),核酶-真核生物rRNA的自身剪切,四膜蟲 26SrRNA 核酶 （ribozyme） 應(yīng)用,前體 6.4 kb 414bp內(nèi)含子 5.986kb 無酶催化，自身剪接 具有催化功能的RNA 切割特異性RNA

13、序列 具特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)-槌頭結(jié)構(gòu) 人工合成核酶的槌頭結(jié)構(gòu) 破壞HIV病毒,底物,催化部分,圖13-11,酶,底物,圖13-12,2、tRNA的加工,堿基修飾 3端 5端 切除反密碼環(huán) 的內(nèi)含子,轉(zhuǎn)位 - T 脫氨 - AMP IMP 還原 - DHU 甲基化- mA mG CCA-OH RNaseP切除多余的核苷酸 RNaseP 在前tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,3、真核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：hnRNA + 蛋白質(zhì) 不均一核糖核蛋白（hnRNP）,真核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工步驟：,加帽 加尾 mRNA前體的剪接,5端：m7GpppGpN 作用:穩(wěn)定mRNA 5端 和翻譯的起始有關(guān) 3

14、端: polyA尾巴 作用：穩(wěn)定mRNA 和翻譯模板活性有關(guān) 剪除內(nèi)含子，連接外顯子,5 pppGp,（1）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工-“加帽”,帽0 帽1 帽2,m7GpppGpN m7GpppGmpN m7GpppGmpNm,三種5帽結(jié)構(gòu)形式,步驟1,步驟2,作用位置,200250,（2）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工-加polyA尾,外顯子,內(nèi)含子,DNA,hnRNA,（3）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工剪接,剪接所需條件 snRNA （U1-U6） + 蛋白質(zhì) （核內(nèi)小分子核酸） 多種snRNP （核內(nèi)小核蛋白顆粒） 多種snRNPs裝配成 剪接體 （參與剪接過程）,4、RNA編輯（RNA e

15、diting）（1）一種與RNA加帽、加尾、剪接不同的RNA 加工形式。（2）轉(zhuǎn)錄后改變RNA的序列，使熟RNA的序列 與基因組DNA序列不同。（3）生物學(xué)中心法則的補(bǔ)充，擴(kuò)大了mRNA遺 傳信息容量。,第2153位,谷氨酰胺,終止子,圖13-18,第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄病毒及癌基因,一、逆轉(zhuǎn)錄 以RNA為模板，有逆轉(zhuǎn)錄酶的參與，在4種dNTP存在及適合的條件下，按堿基配對的原則，合成cDNA（complementary DNA,cDNA）的過程。,二、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase) RNA依賴的DNA聚合酶（RDDP） 這種酶以RNA為模板，在4種dNTP存在及適合的

16、條件下，按堿基配對的原則，合成cDNA (cDNA中無內(nèi)含子）。 催化三種反應(yīng)： RNA指導(dǎo)的DNA合成 RNA水解 DNA指導(dǎo)的DNA合成,ASV RNA,RNA DNA(-),DNA(-),DNA(-) DNA(+),1.RNA指導(dǎo)DNA合成,2.RNA水解,3.DNA指導(dǎo)DNA合成,逆轉(zhuǎn)錄酶的作用,三、逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA病毒）的基因組,1、逆轉(zhuǎn)錄病毒： 雞肉瘤病毒（ASV） Rouse肉瘤病毒（RSV） 小鼠白血病病毒（MuLV) 人類T細(xì)胞白血病病毒（HTLV-I） 愛滋病病毒（HIV） SARS,2、基因組： 兩個(gè)完全相同的單鏈RNA 分子 含有逆轉(zhuǎn)錄酶 含來自宿主的tRNA （合成

17、時(shí)的引物）,ASV（雞肉瘤病毒）的基因組結(jié)構(gòu)-RNA,LTR,gag,pol,env,src,LTR,長末端 重復(fù)序列,正常病毒基因,癌基因,調(diào)節(jié)和 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生病毒 核心蛋白,產(chǎn)生 逆轉(zhuǎn)錄酶,產(chǎn)生病毒 外膜蛋白,產(chǎn)生酪氨酸 激酶,3、逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期 進(jìn)入宿主細(xì)胞 雙鏈RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 雙鏈DNA前病毒 整合到宿主細(xì)胞基因組DNA中 宿主細(xì)胞RNA聚合酶II mRNA 病毒RNA基因組 作為合成相應(yīng) 病毒蛋白質(zhì)的模板 包裝成新的病毒顆粒，離開宿主,二.癌基因(oncogene)和抑癌基因,癌基因 病毒癌基因 (v-onc) 細(xì)胞癌基因 （原癌基因） (c-onc),DNA腫瘤病毒的轉(zhuǎn)化基因 RNA病毒的癌基因（ASV src) 源自細(xì)胞癌基因 使宿主細(xì)胞發(fā)生惡化，形成腫瘤 正常原癌基因?yàn)樯顒?dòng)必需 調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生長和分化 原癌基因激活 基因結(jié)構(gòu)異常/表達(dá)失控 導(dǎo)致細(xì)胞惡變,逆轉(zhuǎn)錄病毒與宿主細(xì)胞基因整合過程示意圖,RNA 病毒粒子,病毒RNA,RNA DNA 逆轉(zhuǎn)錄