第八章 天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機(jī)制.ppt

1、第八章 天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機(jī)制,第八章 天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機(jī)制,重點(diǎn)：天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制；天冬氨酸族氨基酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制；酵母和霉菌的賴氨酸生物合成途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制；賴氨酸生產(chǎn)菌的育種途徑； 難點(diǎn)：天冬氨酸族氨基酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制；,氨基酸本身的合成在不同生物體中，有較大的差異，然而許多氨基酸的合成途徑在不同生物體中也有共同之處。 按照起始物可將氨基酸的合成分成幾個(gè)家族： 谷氨酸族（-酮戊二酸族） 包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸； 丙酮酸族 包括：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸；,天冬氨酸族（草酰乙酸族） 包括：天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和異亮氨

2、酸； 磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸； 芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸； 另外，組氨酸的合成為單獨(dú)的一條途徑。,第一節(jié) 生物合成途徑（天冬氨酸族）及代謝調(diào)控機(jī)制 一、生物合成途徑 天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸為原料，合成蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和賴氨酸。,葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 天冬氨酸 天冬氨酸-半醛 賴氨酸 高絲氨酸 蛋氨酸 蘇氨酸 異亮氨酸,EMP,CO2 固定、氧化,氨基化反應(yīng),天冬氨酸激酶,天冬氨酸-半醛脫氫酶,二氫吡啶二羧酸（DDP）合成酶,高絲氨酸脫氫酶,琥珀酰高絲氨酸合成酶,高絲氨酸激酶,蘇氨酸脫氨酶,二、天冬氨酸族生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制

3、 在細(xì)菌中，雖然天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑是相同的，但是其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制是多種多樣的。 1.大腸桿菌K12 天冬氨酸激酶（ AK） AK:受蘇氨酸、異亮氨酸的多價(jià)抑制和阻遏 天冬氨酸激酶 AK：受蛋氨酸專一性抑制和阻遏 AK：受賴氨酸專一性抑制和阻遏,天冬氨酸-半醛脫氫酶 專一性的受賴氨酸不完全的抑制 二氫吡啶二羧酸（DDP）合成酶（賴氨酸分支的第一個(gè)酶） DDP合成酶受賴氨酸反饋抑制。 二氨基庚二酸（DAP）脫羧酶受賴氨酸阻遏,高絲氨酸脫氫酶（HD）（通向蘇氨酸、蛋氨酸分支的第一個(gè)酶） HD HD：受蘇氨酸反饋抑制 HD：受蛋氨酸阻遏 蘇氨酸脫氨酶（異亮氨酸合成途徑的酶） 受異亮氨酸的反饋抑

4、制和阻遏,2.黃色短桿菌 其賴氨酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制比大腸桿菌簡(jiǎn)單，其天冬氨酸激酶只有一種，該酶具有兩個(gè)變構(gòu)部位，可以與終產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)只有一種終產(chǎn)物（賴氨酸或蘇氨酸）與酶結(jié)合，酶活性不受影響。當(dāng)兩種終產(chǎn)物（賴氨酸和蘇氨酸）同時(shí)過量時(shí)，與酶的兩個(gè)變構(gòu)部位結(jié)合，該酶活性受到抑制，這種終產(chǎn)物的反饋抑制稱為協(xié)同反饋抑制。P74圖6-3,3.乳糖發(fā)酵短桿菌賴氨酸合成調(diào)節(jié) P75，圖6-5 1）存在代謝優(yōu)先向蘇氨酸和蛋氨酸方向進(jìn)行。 2）與黃色短桿菌區(qū)別： AK受賴氨酸+蘇氨酸的反饋抑制 存在代謝互鎖，DDP合成酶的合成受亮氨酸阻遏。DDP還原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。,三、酵母和霉菌的賴氨酸生物合成途徑和

5、調(diào)節(jié)機(jī)制 所謂同型TCA循環(huán)途徑進(jìn)行，但生物合成酶與TCA循環(huán)酶完全兩樣。,第二節(jié) 賴氨酸生產(chǎn)菌的育種途徑,出發(fā)菌株的選擇：要求代謝比較簡(jiǎn)單的細(xì)菌（如黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳酸發(fā)酵短桿菌等） 1.優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換：滲漏缺陷型的選育。 降低高絲氨酸脫氫酶活性，使代謝流轉(zhuǎn)向優(yōu)先合成賴氨酸。 高絲氨酸脫氫酶滲漏缺陷型。,2.切斷支路代謝：營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育。 黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌，對(duì)天冬氨酸激酶的反饋抑制是賴氨酸+蘇氨酸的協(xié)同作用，通過誘變使高絲氨酸脫氫酶缺失，切斷通向蘇氨酸、蛋氨酸的代謝流，控制高絲氨酸（或蘇氨酸+蛋氨酸）量，降低蘇氨酸濃度，解除協(xié)同反饋?zhàn)饔?，過量積累賴氨酸。,3.抗結(jié)構(gòu)類似物

6、突變株的選育（代謝調(diào)節(jié)突變）。 優(yōu)點(diǎn)：突變株遺傳性地解除了終產(chǎn)物對(duì)自身合成途徑的酶的調(diào)節(jié)控制，不受培養(yǎng)基中所要求物質(zhì)濃度的影響，生產(chǎn)較穩(wěn)定。 通過誘變使天冬氨酸激酶編碼的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，對(duì)賴氨酸及結(jié)構(gòu)類似物不敏感，即使有過量蘇氨酸存在，該酶也不與賴氨酸或結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合，但酶活性中心不變。,4.解除代謝互鎖 選育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的賴氨酸的生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變得到抗AEC兼抗亮氨酸缺陷型菌株。 選育抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株，從遺傳上解除亮氨酸對(duì)DDP合成酶的阻遏。 選育對(duì)苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，這是一種尋找亮氨酸滲漏缺陷型菌株的有效方法。,5.增加前體物的生物合成和阻塞產(chǎn)

7、物的生成： 方法： 選育丙氨酸缺陷型； 選育抗天冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株； 選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株； 1.通過TCA循環(huán) 葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸 賴氨酸 2.通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化反應(yīng) 葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸 丙酮酸 賴氨酸,6.改變細(xì)胞膜的透過性 7.選育溫度敏感突變株 天冬氨酸系分枝代謝途徑中，末端產(chǎn)物種類多，調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，為高效率生產(chǎn)賴氨酸，可以采取順次解除各種調(diào)節(jié)機(jī)制的誘變育種，獲得多重標(biāo)記的突變株。,8.應(yīng)用細(xì)胞工程和遺傳工程育種 9.防止高產(chǎn)菌株回復(fù)突變 選育遺傳性穩(wěn)定的菌株 定向賦加生產(chǎn)菌多個(gè)遺傳標(biāo)記 菌種培養(yǎng)和保藏時(shí)，培養(yǎng)基要豐富

8、，尤其有足夠的要求營(yíng)養(yǎng)物 培養(yǎng)時(shí)添加抗生素，抑制恢復(fù)突變株的生長(zhǎng)，達(dá)到分純的目的。,第三節(jié) 蘇氨酸、蛋氨酸、高絲氨酸和天冬氨酸的育種途徑,一、蘇氨酸的育種途徑,蘇氨酸高產(chǎn)菌株應(yīng)具備的生化特征,DDP合成酶活力極弱或欠缺 琥珀酰高絲氨酸合成酶酶活力極弱或欠缺 蘇氨酸脫氨酶酶活力極弱或欠缺 CO2固定能力強(qiáng) 天冬氨酸合成能力強(qiáng) 天冬氨酸激酶活力強(qiáng)，對(duì)蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制不敏感 高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng)，不受蘇氨酸反饋調(diào)節(jié)。,二、高絲氨酸菌種的選育途徑,DDP合成酶活力極弱或欠缺 琥珀酰高絲氨酸合成酶酶活力極弱或欠缺 高絲氨酸激酶欠缺 CO2固定能力強(qiáng) 天冬氨酸合成能力強(qiáng) 天冬氨酸激酶活力強(qiáng)，對(duì)蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制不敏感 高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng)，不受蘇氨酸和蛋氨酸反饋調(diào)節(jié)。,高產(chǎn)高絲氨酸菌株應(yīng)具備的生化特征,三、蛋氨酸育種途徑,高產(chǎn)蛋氨酸應(yīng)具備的生化特性,DDP合成酶活力極弱或欠缺 S-腺苷蛋氨酸酶活力極弱或欠缺 高絲氨酸激酶欠缺 CO2固定能力強(qiáng) 天冬氨酸合成能力強(qiáng) 天冬氨酸激酶活力強(qiáng)，對(duì)蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制不敏感 高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng)，蘇氨酸和異亮氨酸