第七章 蛋白質(zhì)翻譯后修飾與加工.ppt

1、第七章 蛋白質(zhì)翻譯后修飾與加工,蛋白質(zhì)翻譯后修飾, 是指在mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)后, 對蛋白質(zhì)上個(gè)別氨基酸殘基進(jìn)行共價(jià)修飾的過程. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用. 人類基因組計(jì)劃的完成是20世紀(jì)最偉大的科技成果之一。在對人類基因組進(jìn)行仔細(xì)研究后發(fā)現(xiàn), 人類基因大約有 30000-50000 個(gè)，這僅僅是線蟲和果蠅染色體基因數(shù)的 3-5倍. 而生命體內(nèi)復(fù)雜生命過程的調(diào)控, 僅僅靠這樣小數(shù)目的基因遠(yuǎn)不能滿足需要。 因此, 蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程尤為重要，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜, 功能更為完善, 調(diào)節(jié)更為精細(xì), 作用更為專一。 細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)的功能,是通過動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾來調(diào)

2、控的; 細(xì)胞的許多生理功能, 例如細(xì)胞對外界環(huán)境的應(yīng)答, 也是通過動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾來實(shí)現(xiàn)的。人類生命過程的復(fù)雜性不單是基因直接表達(dá)的結(jié)果, 正是蛋白質(zhì)翻譯后修飾, 使得一個(gè)基因并不只對應(yīng)一個(gè)蛋白質(zhì), 從而賦予人類生命過程更多的復(fù)雜性.,在真核動物細(xì)胞中有20多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，常見的有泛素化、磷酸化與去磷酸化、糖基化與去糖基化、脂基化、甲基化和乙?；?。,近年來, 隨著人類基因組和蛋 白質(zhì)組學(xué)工作的開展, 關(guān)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究也取得一系列進(jìn)展. 磷酸化涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等生理病理過程; 糖基化在許多生物過程中如免疫保護(hù)、病毒的復(fù)制、

3、細(xì)胞生長、炎癥的產(chǎn)生等起著重要的作用; 脂基化對于生物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程起著非常關(guān)鍵的作用; 組蛋白上的甲基化和乙?；c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。 在體內(nèi)，各種翻譯后修飾過程不是孤立存在的。,原核生物中肽鏈起始合成時(shí)，N端為甲酰甲硫氨酸，真核肽鏈合成時(shí)N端是甲硫氨酸，但是成熟的蛋白質(zhì)中N端并無甲酰甲硫氨酸，大多數(shù)蛋自質(zhì)的N端也不是甲硫氨酸。 在生物合成過程中新生的肽鏈N端由去甲酞基酶去除甲酰甲硫氨酸殘基的甲?；彪拿溉コ齆端甲硫氨酸或N端某些氨基酸殘基。一些分泌性蛋白質(zhì)、激素及酶最初合成的是不具有生物活性的前體，如白蛋白原、胰島素原等。 蛋白質(zhì)前體要經(jīng)過蛋白酶切割，去除一部分肽段后才具有活性。它可以分為

4、兩種類型：蛋白質(zhì)前體在細(xì)胞內(nèi)被加工成有生物活性的蛋白質(zhì)，然后分泌到胞外；蛋白質(zhì)前體被分泌到胞外或消化道，被蛋白酶加工成有生物活性的蛋白質(zhì)，如前膠原分子活化為膠原分子，胰蛋白酶原激活等。,第一節(jié) 蛋白質(zhì)的糖基化,大多數(shù)蛋白質(zhì)以糖蛋白形式存在,它們包括酶、免疫球蛋白、載體蛋白、激素、毒素、凝集素和結(jié)構(gòu)蛋白,功能涉及細(xì)胞識別、信息傳遞、激素調(diào)節(jié)、受精、發(fā)生、發(fā)育、分化、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)恒態(tài)維持等各個(gè)方面。而且知道,病菌、病毒的侵染，癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移,自身免疫疾病等都與細(xì)胞表面的糖密切相關(guān)。 糖蛋白是蛋白質(zhì)通過共價(jià)鍵與糖類結(jié)合的復(fù)合物，其中的糖基少則只有一個(gè)，多則可達(dá)數(shù)百個(gè)，后者的糖基常常連接成寡

5、糖鏈，又稱為聚糖（glycan）。,1，糖肽連接鍵的類型,一條寡糖鏈與蛋白質(zhì)中氨基酸殘基可通過多種方式共價(jià)連接，從而構(gòu)成糖蛋白的糖肽連接鍵（簡稱糖肽鍵）。參與糖肽共價(jià)連接的氨基酸種類較少，常見的是絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、羥賴氨酸、羥脯氨酸。,O-糖肽鍵連接,N-糖肽鍵連接,GalNAc 乙酰半乳糖胺 GlcNAc 乙酰葡萄糖胺,Roles of oligosaccharides in recognition and adhesion at the cell surface,(2)凝集素的特異結(jié)合作用,凝集素是一類廣泛存在于自然界的一大類非免疫來源的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它能與糖專一性地、非共價(jià)地可

6、逆結(jié)合，并且有凝集血細(xì)胞的作用，故稱為凝集素。 凝集素可與糖專一性地結(jié)合。目前按結(jié)合糖的類型，凝集素可分為六類： D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖； N-乙酰氨基半乳糖； D-半乳糖； L-巖藻糖；唾液酸。 在植物凝集素中，只有麥胚凝集素（WGA）可專一結(jié)合唾液酸。,細(xì)胞間的粘附是細(xì)胞間相互作用起決定性作用的起始步驟。作為致病的微生物，首先對宿主細(xì)胞進(jìn)行粘著，然后才能感染和致病。 細(xì)胞表面的凝集素能專一地識別并結(jié)合另一細(xì)胞的糖鏈。凝集素的這種特性，在細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基質(zhì)的粘附中起一定作用。,1990年11月，三個(gè)小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子1（ELAM1），后改稱E選擇

7、素（E-selectin），又稱為動物凝集素，能識別白細(xì)胞表面的SLex(一種血型抗原)四聚糖。 當(dāng)組織受損或感染時(shí)，白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，沿血管壁滾動并穿過管壁進(jìn)入受損組織，殺滅入侵病原物，但過多的白細(xì)胞聚集，則會引起炎癥及類風(fēng)濕等自身免疫疾病。,美籍華裔科學(xué)家王啟輝首先用酶法合成了SLex，并已由Cytel公司生產(chǎn)。Glycomed公司則從中藥甘草中，找到了SLex的類似物甘草素，可用于封閉血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的E選擇蛋白，從而達(dá)到抗炎的目的。,Slex及其模擬物的結(jié)構(gòu),（3）構(gòu)成某些抗原的決定子,聚糖與細(xì)胞和生物分子的一個(gè)很重要的特性就是表型和抗原性，據(jù)此細(xì)胞和分子能彼此區(qū)別，人類的ABO血

8、型以及相關(guān)血型抗原性是由糖鏈決定的。A型和B型抗原決定簇的不同只是在于糖蛋白和糖脂中的糖鏈的非還原端的一個(gè)糖殘基：A型為N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)；B型為半乳糖(Gal)。 A型血的個(gè)體，他們的血液中含有抗B型糖鏈結(jié)構(gòu)的抗體；B型血的個(gè)體，其血液中則有抗A型糖鏈結(jié)構(gòu)的抗體。一旦輸入不同血型的血液，就有可能引起免疫反應(yīng)。O型血的個(gè)體的相應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)少了AB抗原非還原端的Gal或GalNAc。為此，這樣的糖鏈結(jié)構(gòu)不會和抗A或抗B的抗體結(jié)合引起免疫反應(yīng)。這樣的血型抗原物質(zhì)不僅存在于一些紅細(xì)胞的表面，而且也存在于一些表皮細(xì)胞的表面。,三、糖蛋白的生物合成,糖蛋白是復(fù)合蛋白，因此，糖蛋白的生物合

9、成自然包括蛋白質(zhì)的合成和糖鏈合成兩個(gè)部分。糖蛋白中蛋白部分的合成和其他蛋白質(zhì)的合成一樣是在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上進(jìn)行，只是在肽鏈生物合成的同時(shí)或合成后，糖鏈作為一種翻譯后加工的過程被接到肽鏈上的特定的糖基化位點(diǎn)。 糖鏈的存在對肽鏈的折疊，糖蛋白的進(jìn)一步的成熟、分揀、投送，以及最后的定位都有重要的影響。,1，N-糖鏈的合成,N-寡糖鏈前體的開始合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行，隨后又在高爾基體內(nèi)加工，全部合成大致可分為四步進(jìn)行。 （1）合成以酯鍵相連的寡糖鏈前體； （2）將寡糖鏈前體轉(zhuǎn)移到正在增長著的肽鏈上； （3）除去寡糖鏈前體中的某些糖單位； （4）在剩余的寡糖核心上在加上另外的糖單位。,1）寡糖鏈前體的合成

10、,2）寡糖鏈前體的轉(zhuǎn)移,在寡糖鏈前體生物合成后，被完整地轉(zhuǎn)移到新生肽鏈的某些N-糖基化位點(diǎn)上（反應(yīng)1），在合成過程中作為糖基載體的Dol-P-P被游離出來。Dol-P-P經(jīng)磷酸酶水解釋放出無機(jī)磷酸，變成磷酸長萜醇被循環(huán)使用。,3）寡糖鏈前體的后加工,轉(zhuǎn)移到新生肽鏈上的寡糖鏈前體的后加工開始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，首先由兩個(gè)不同的-葡萄糖苷酶分別切除由Man延伸的3個(gè)Glc（反應(yīng)2-3）和1個(gè)Man（反應(yīng)4），隨后尚未完成加工過程的糖蛋白被裹在由膜形成的囊泡中轉(zhuǎn)移到高爾基體進(jìn)一步加工。,4）N-糖鏈的成熟,N-糖鏈的成熟過程是在高爾基體內(nèi)進(jìn)行的。在糖蛋白通過高爾基體膜囊的途中，甘露糖殘基已經(jīng)過修剪，N-乙酰葡

11、萄糖胺、半乳糖、巖藻糖以及唾液酸殘基都根據(jù)需要連接到糖蛋白分子上，從而完成它的加工（反應(yīng)1-7）。,3，O-糖鏈的生物合成,O-糖鏈的結(jié)構(gòu)比N-糖鏈簡單，但是種類比N-糖鏈多，肽鏈中可以糖基化的主要是絲氨酸和蘇氨酸，此外還有酪氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸，連接的位點(diǎn)是這些殘基側(cè)鏈上的羥基氧原子，后者可以和很多種單糖生成糖苷鍵，其中以通過GalNAc和絲氨酸或蘇氨酸殘基相連的O-糖鏈(以下簡稱為O-GalNAc糖鏈)研究得最多，這是因?yàn)檫@類O-糖鏈分布最廣。 為此O-糖鏈的生物合成中也以O(shè)-GalNAc糖鏈的生物合成研究得最詳細(xì)。,狗頜下唾液腺O-連接糖鏈的合成途徑,O-糖鏈生物合成過程最清楚的是黏

12、蛋白的生物合成，黏蛋白是由頜下唾液腺分泌的一種O-連接糖蛋白，它的合成是在高爾基體中進(jìn)行的。,四、蛋白糖基化和去糖基化的化學(xué)調(diào)控,在生物體內(nèi)，大多數(shù)蛋白質(zhì)都是以糖蛋白形式存在，它們包括酶、免疫球蛋白、載體蛋白、激素、毒素、凝集素和結(jié)構(gòu)蛋白，涉及到細(xì)胞識別、信息傳遞、激素調(diào)節(jié)、受精、發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)恒態(tài)維持等各個(gè)方面的功能。 許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，如炎癥及自身免疫疾病、老化、癌細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移、病原體感染等都與糖蛋白寡糖鏈的變化密切相關(guān)。 因此，針對糖鏈的變化，利用小分子化合物抑制糖苷轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的催化活性，可以控制糖鏈的合成和水解，從而達(dá)到治療疾病的目的。,糖蛋白的去糖基化酶,去糖

13、基化的目的有三: (一)檢測碳水化合物在糖蛋白功能中的作用。(二)測定糖蛋白中蛋白質(zhì)部分的分子量,尤其在重組DNA研究中,證明所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是否為目的蛋白。(三)制備抗蛋白質(zhì)抗體。 去糖基酶有三類:外切型糖苷酶、內(nèi)切型糖苷酶和糖胺酶(N-糖肽酶)。 外切型糖苷酶能從糖鏈的非還原末端釋放寡糖。例如:唾液酸酶、-半乳糖苷酶、-N-乙酰氨基葡萄苷酶、-L-果糖苷酶、-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、-甘露糖苷酶、-甘露糖苷酶等等。 這些酶的應(yīng)用有助于研究糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。例如:促紅細(xì)胞生成素的去糖基化,當(dāng)末端的糖即唾液酸、半乳糖、G1cNAc被專一性的糖苷酶去掉時(shí),在體外測其活性逐漸提高,進(jìn)一步切去內(nèi)

14、部糖鏈則導(dǎo)致活性喪失。,內(nèi)切型糖苷酶有如下幾類：這些酶由于都是從糖鏈內(nèi)部專一性切開某個(gè)鍵，因此在糖鏈結(jié)構(gòu)分析以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中非常有用，也是目前糖基化工程中的重要酶,，可應(yīng)用于生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域。 例如：近年來內(nèi)切型-半乳糖苷酶結(jié)合單克隆抗體，免疫化學(xué)方法檢測紅細(xì)胞表面帶有血型Ii-抗原的乳糖胺聚糖以及由聚乳糖胺修飾末端的各種抗原包括ABH和SSEA-1(Lex)，建立了正常人紅細(xì)胞聚乳糖胺輪廓，并分析了遺傳性貧血病人的不正常糖基化輪廓。發(fā)現(xiàn)這類病人的紅細(xì)胞含增高的聚乳糖胺神經(jīng)酰胺。和乳糖系列的糖脂,而其中有兩條糖蛋白帶很少被聚乳糖胺糖基化。這是一種糖基化缺陷病，現(xiàn)已對該病進(jìn)行了廣泛的分子

15、生物學(xué)研究。,糖胺酶(Glycoamidase, N-糖苷酶)，這類酶目前主要有兩類:糖胺酶A (來自Almond)和糖胺酶F (來自flavobacterium meningo septicum),都水解寡糖-G1cNAc-Asn-肽,釋放出完整的寡糖,并且對寡糖結(jié)構(gòu)特異性較寬,甘露糖型、復(fù)合型、雜合型糖鏈均可釋放,包括所有含果糖基,含二分型Glc-NAc、-木糖、Gal-GlcNAc重復(fù)單位以及含唾液酸基的N-乙酰乳糖氨型寡糖。但對肽分子專一性較強(qiáng),只能釋放含3-40個(gè)氨基酸的糖肽分子的糖基,對肽中氨基酸序列有一定要求。 目前使用較多的為糖胺酶A,是分析N-糖鏈的有用工具,結(jié)合核磁共振,甲

16、基化分析和外切型糖苷酶消化常用來定性分析由二維圖譜分離的寡糖。,1,-葡萄糖苷酶抑制劑,-葡萄糖苷酶在機(jī)體的許多代謝過程中起著關(guān)鍵的作用，并與許多因代謝紊亂失調(diào)而引發(fā)的疾病有密切關(guān)系，如糖尿病、癌癥、病毒感染等。 對腸道-葡萄糖苷酶具有抑制作用的一些化合物已成為治療糖尿病的一類新藥，如已經(jīng)上市的治療糖尿病的拜糖平和米格列醇等。 在寡糖鏈生物合成中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)有兩種-葡萄糖苷酶催化寡糖鏈前體最末端的3個(gè)葡萄糖基，以利于N-寡糖鏈的形成。因此，能夠阻斷寡糖鏈生物合成的-葡萄糖苷酶抑制劑，也被用作抗病毒和抗腫瘤的藥物。,目前人們發(fā)現(xiàn)的-葡萄糖苷酶抑制劑可分為糖及其衍生物與非糖基化合物，其中糖及其衍生物

17、按照已有文獻(xiàn)分類，又可分為單糖類、雙糖類、亞氨基糖類，碳糖與假糖氨類與硫糖類。其中研究比較多的-葡萄糖苷酶抑制劑屬于亞氨基糖類（多羥基生物堿類）化合物，包括多羥基哌啶類、多羥基吡咯烷類、多羥基雙稠吡咯烷類、多羥基吲哚里西啶類、多羥基去甲莨菪烷類、氨基環(huán)醇類等。,作為抗腫瘤、抗病毒使用的-葡萄糖苷酶抑制劑，需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，所以必須增加化合物的疏水性，例如已經(jīng)上市的N-丁基-1-脫氧尻霉素（N-丁基-DNJ）和生物堿粟精胺的衍生物，即6-O-丁酰粟精胺酯（6-O-butyl-cast）等，可用做抗艾滋病、抗肝炎病毒藥物。,近幾年，人們也在一些糖類抑制劑基礎(chǔ)上，開發(fā)出了幾種較好的對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-葡萄糖

18、苷酶I和-葡萄糖苷酶II具有較強(qiáng)抑制作用的糖類抑制劑。,人們根據(jù)天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，也設(shè)計(jì)合成、篩選出幾種新型的結(jié)構(gòu)獨(dú)特的-葡萄糖苷酶抑制劑，如 4-甲基磺酰胺基查爾酮衍生物、4-甲基磺酰胺基苯甲酮衍生物，四氯鄰苯二甲酰亞胺衍生物、二苯基脲衍生物、羥基肉桂酰苯乙胺、綠原酸衍生物等，其IC50值達(dá)到0.006-0.4mol/L。,2，-甘露糖苷酶抑制劑,-甘露糖苷酶I和II主要存在高爾基體中，-甘露糖苷酶抑制劑不影響寡糖鏈前體中葡萄糖基的切除，但是可以終止N-糖鏈的進(jìn)一步加工成復(fù)合型糖鏈，結(jié)果得到的糖鏈為高甘露糖型或雜合型的糖鏈結(jié)構(gòu)。,甘露糖的衍生物甘露糖-1-脫氧尻霉素（DMJ）對-甘露糖苷酶

19、I具有較強(qiáng)的抑制作用?？囫R豆堿（swainsonine, swain）是-甘露糖苷酶II的特異性抑制劑，它能改變細(xì)胞表面的糖類抗原決定部位的表達(dá)，進(jìn)而影響到腫瘤的轉(zhuǎn)移和入侵，以及在體外的生長，表現(xiàn)出抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。,3，糖苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑,糖基轉(zhuǎn)移酶是糖基化過程的關(guān)鍵酶。由于許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中，糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性增高，導(dǎo)致糖鏈的天線數(shù)目增加，因此，糖苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以作為治療某些疾病的特異性藥物。 目前所發(fā)現(xiàn)的糖苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑大多數(shù)是根據(jù)該酶催化反應(yīng)的底物結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制設(shè)計(jì)合成的，如人們設(shè)計(jì)了多種UDP-Gal類似物作為-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑以及N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。,4

20、，神經(jīng)氨酸酶抑制劑,流感病毒表面有兩種糖蛋白：神經(jīng)氨酸酶和血凝素。神經(jīng)氨酸酶（NA)可催化裂解宿主細(xì)胞和病毒粒血凝素和NA上糖側(cè)鏈末端的唾液酸殘基，從而促進(jìn)病毒粒子從感染的呼吸道粘膜向周圍組織擴(kuò)散。 此外NA還同樣具有病毒的致病性，通過改變表面糖蛋白血凝素的碳水化合物部分，增強(qiáng)病毒株的毒性，可引起流感癥狀和氣道炎癥的發(fā)生。 神經(jīng)氨酸酶（又稱為唾液酸酶，NA）抑制劑通過選擇性地抑制、型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶，使病毒難以釋放，并促進(jìn)已釋放的病毒相互凝聚，繼而死亡。,流感病毒,流感病毒大致分甲、乙、丙三種類型。其中，甲型攻擊力最強(qiáng)，而且極易變異，造成爆發(fā)或大流行。甲型流感病毒主要就是血凝素和神經(jīng)氨酸酶

21、的變異。病毒學(xué)家給編上了不同的編號，如H1、H2、N1、N2等。其中可以有一種或兩種以上發(fā)生變異，專家根據(jù)這些編號給流感病毒分類。,第一個(gè)可抑制流感病毒NA的抑制劑是2-脫氧-2,3-脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA，Neu5Ac2en)，但由于活性及其特異性太低，無臨床使用價(jià)值。后來根據(jù)NA與底物唾液酸復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)合成了4-胍基DANA(Zanamivir，扎那他韋)，對流感病毒NA抑制效果提高500倍。 1997年設(shè)計(jì)了一種新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑Oseltamivir(奧司他韋)，其與流感病毒NA比對人的同類酶的親和力大100萬倍，被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的特異性最高的藥物，該藥物于1999年在

22、北美、歐洲和日本等地上市。 此外還有多種神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物正處于前期開發(fā)中，如BANA-113、A-192558等。,6，糖蛋白糖鏈擴(kuò)展,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的磷酸化,當(dāng)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域之一是關(guān)于細(xì)胞代謝、生長、分化、增殖和癌變調(diào)控的分子機(jī)理研究。 這個(gè)問題與生物信號分子如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子（包括生長因子）、癌蛋白以及某些藥物所攜帶的生物信息在細(xì)胞內(nèi)傳遞密切相關(guān)。,研究表明，生物信號在細(xì)胞內(nèi)傳遞的基本方式是蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化，即“可逆蛋白質(zhì)磷酸化作用”。 美國西雅圖華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院兩位生物化學(xué)家克雷布斯（E.G.Krebs）和費(fèi)希爾（E.

23、H. Fischer）由于他們在20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)了“可逆蛋白質(zhì)磷酸化作用”而榮獲1992年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。 40多年來，特別是近20年來“可逆蛋白質(zhì)磷酸化作用”的研究有了極大的發(fā)展，現(xiàn)在擴(kuò)展到整個(gè)分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在真核細(xì)胞內(nèi)就有400多種蛋白激酶和上千種磷酸化的蛋白以及種類繁多的蛋白磷酸酶。 這些蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化多種功能蛋白，如酶、激酶、受體、離子泵、離子通道、收縮蛋白、運(yùn)輸?shù)鞍?、調(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)蛋白（組蛋白和非組蛋白，特別是轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期蛋白）等，功能蛋白通過磷酸化和去磷酸化時(shí)兩種構(gòu)象互變所導(dǎo)致的活性、性質(zhì)的改變而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種生命過程。,一、蛋白激酶,

24、蛋白激酶是一類磷酸轉(zhuǎn)移酶，其作用是將 ATP 的 磷酸基轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質(zhì)磷酸化。 蛋白激酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中主要作用有兩個(gè)方面：其一是通過磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，磷酸化和去磷酸化是絕大多數(shù)信號通路組分可逆激活的共同機(jī)制，有些蛋白質(zhì)在磷酸化后具有活性，有些則在去磷酸化后具有活性；其二是通過蛋白質(zhì)的逐級磷酸化，使信號逐級放大，引起細(xì)胞反應(yīng)。,蛋白激酶分類,真核生物中發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶很多，根據(jù)其底物蛋白被磷酸化的氨基酸殘基種類，可將它們分為5類 絲氨酸/蘇氨酸(SerThr)蛋白激酶：蛋白質(zhì)的羥基被磷酸化； 酪氨酸(Tyr)蛋白激酶：蛋白質(zhì)的酚羥基作為磷受體； 組氨酸蛋白激酶：蛋白質(zhì)的

25、組氨酸、精氨酸或賴氨酸的堿性基團(tuán)被磷酸化； 色氨酸蛋白激酶：以蛋白質(zhì)的色氨酸殘基作為磷受體； 天冬氨酰基/谷氨?；鞍准っ福阂缘鞍踪|(zhì)的?；鶠榱资荏w。,此外，根據(jù)磷酸化的底物不同，還可將蛋白激酶分為組蛋白蛋白激酶、酪蛋白蛋白激酶等，但由于蛋白激酶可磷酸化底物的多樣化，這種分法很不確切，已經(jīng)被根據(jù)底物磷酸化氨基酸的分類方法所取代，有些如酪蛋白蛋白激酶，只是由于習(xí)慣而一直被沿用下來。 根據(jù)有無調(diào)節(jié)物將蛋白激酶分為信使依賴的蛋白激酶和非信使依賴的蛋白激酶，有些信使依賴的蛋白激酶的首字母縮略詞已為人們所接受，如cAMP依賴的蛋白激酶PKA、鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC以及鈣依賴鈣調(diào)素不依賴的蛋白激酶CD

26、PK等，它們彼此間存在結(jié)構(gòu)和功能上的相關(guān)關(guān)系。,二、蛋白磷酸酶,從理論上講，蛋白磷酸酶在細(xì)胞內(nèi)的生物信息傳遞中與蛋白激酶同樣重要。但實(shí)驗(yàn)研究遠(yuǎn)不如蛋白激酶清楚。 已發(fā)現(xiàn)的蛋白磷酸酶分兩類：一類是特異催化蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸磷酯鍵水解的蛋白磷酸酶（PP）；另一類是特異催化蛋白質(zhì)酪氨酸磷酯鍵水解的酪氨酸蛋白磷酸酶（TPP）。,蛋白磷酸酶分類,蛋白酪氨酸磷酸酶,蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase，PTP)是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)節(jié)因子，與蛋白酪氨酸激酶(Proteintyrosinekinase，PTK)一起控制著細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化水平，調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能

27、隨著對PTP的深入研究，它們在人類內(nèi)分泌疾病中的重要性被逐漸認(rèn)識，特別是某些PTP對2型糖尿病(DM2)的發(fā)生發(fā)展具有更重要的意義，因而可成為抗DM2藥物的作用靶點(diǎn),PTP的結(jié)構(gòu)和功能,PTP是一個(gè)多樣化酶系，主要分為酪氨酸特異性雙特異性和低分子質(zhì)量磷酸酶3大類酪氨酸特異性和低分子質(zhì)量磷酸酶主要作用于含磷酸化酪氨酸的蛋白質(zhì)，雙特異性磷酸酶作用于含磷酸化絲氨酸或含磷酸化蘇氨酸的蛋白質(zhì) 其中酪氨酸特異性磷酸酶又分為以CD45PTP為代表的受體樣PTP和以PTP 1B(PTPase1B)SHP 2(srchomology 2con tainingPTPase)為代表的胞內(nèi)PTP,PTP與2型糖尿病的

28、關(guān)系,胰島素受體是一種通過與配體結(jié)合而被激活的跨膜酪氨酸激酶，其本身和下游底物酪氨酸的磷酸化可激活一系列胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，而引發(fā)適當(dāng)?shù)纳锓磻?yīng)，使體內(nèi)糖代謝得以維持自身平衡 調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)重要因素是PTP，后者既可作用于胰島素受體(Insulin receptor，IR)，又可同時(shí)作用于胰島素受體的底物(IRS)其中IRS 1(Insulin Receptor Substrate 1)是胰島素受體酪氨酸激酶的底物蛋白，能與含SH2(src homology2)的蛋白質(zhì)結(jié)合。,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的乙酰化,蛋白質(zhì)乙?；制毡椋烙?jì)體內(nèi)50的蛋白質(zhì)有末端氨基的乙酰化，它能延長蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存

29、在的時(shí)間。近年來發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙?；诨罨旧|(zhì)，使它作為轉(zhuǎn)錄及復(fù)制的模板中起重要作用。 組蛋白的乙?；怯山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶催化的，目前已發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子本身就是這一種酶。例如人細(xì)胞核中的TATA結(jié)合蛋白(TBP)的某些亞基可使H3和H4乙酰化。 乙酰化的組蛋白可被組蛋白脫乙?；复呋コ阴；?，因此核心組蛋白乙酰化狀態(tài)的調(diào)控在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也起著重要的作用。,五種主要類型的組蛋白,組蛋白尾部的修飾,在5 種組蛋白中,除H1 的N 末端富含疏水氨基酸,C末端富含堿性氨基酸之外,其余4 種都是N 末端富含堿性氨基酸(如精氨酸賴氨酸),C 末端富含疏水氨基酸(如纈氨酸異亮氨酸) 在形成聚合體的過程

30、中,組蛋白H2AH2BH3 H4 的C 端的疏水氨基酸相互結(jié)合,而N 端的堿性氨基酸則向四面伸出,以便與DNA 分子相互作用,伸出的堿性氨基酸就是“組蛋白的尾巴”其中H4具有最長的尾部 H1與DNA分子結(jié)合,鎖住了核小體的進(jìn)出口,使DNA分子的結(jié)構(gòu)更加致密,組蛋白尾部形成的空間結(jié)構(gòu)約占整個(gè)組蛋白多聚體的25 %30 %,從而為蛋白質(zhì)或DNA的相互作用提供了開放的表面組蛋白的尾部可以與核小體或連接DNA相互作用,使核小體間發(fā)生蛋白-蛋白或蛋白-DNA相互作用,或與非核小體蛋白,甚至與自身相互作用 組蛋白的球形部和尾部都會發(fā)生翻譯后修飾,但由于其尾部暴露在核小體之外,容易受酶如乙酰化酶甲基化酶和激

31、酶等的作用而更容易發(fā)生,是主要的翻譯后修飾部位 在組蛋白尾部區(qū)域常發(fā)生的翻譯后修飾包括:乙?；姿峄谆核鼗约癆DP 核糖基化等,乙?；揎?乙?；亲钤绫话l(fā)現(xiàn)的與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的組蛋白修飾方式乙酰化由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶HAT ( histone acetyl transferase )催化,去乙?；山M蛋白去乙酰基酶HDAC ( histone deacetyl transferase)催化 乙?；饕l(fā)生在組蛋白H3和H4的尾部比較保守的賴氨酸(Lys)殘基上,使其氨基發(fā)生乙?；?主要的乙?；稽c(diǎn)包括H3的9 14 18 和23 位的賴氨酸,H4的5812和16位的賴氨酸等,組蛋白乙?；?

32、去乙酰化作用參與了真核基因組整體表達(dá)水平的調(diào)控;組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶組蛋白去乙?；傅冉M蛋白修飾酶的一個(gè)非常重要的甚至是最主要的功能是通過造成基因組水平迅速的乙酰化 去乙?；h(huán)實(shí)現(xiàn)基因組整體水平的調(diào)控 基因組具備較低的基礎(chǔ)乙?；接袃蓚€(gè)明顯的好處:(1)方便地開啟或關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄;(2)實(shí)現(xiàn)包括基因組水平上復(fù)制和DNA損傷修復(fù)在內(nèi)的整體調(diào)控,組蛋白乙酰化/去乙?；c基因表達(dá)調(diào)控,人們很早就發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰化與基因活化有關(guān),而去乙?；c基因沉默有關(guān)目前認(rèn)為組蛋白乙?；?去乙?；饕ㄟ^以下幾種方式影響基因的表達(dá) 一是組蛋白乙?；?去乙?；淖兒诵◇w周圍環(huán)境,加強(qiáng)或削弱基因表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)與DNA的相互

33、作用; 二是組蛋白乙?；?去乙酰化參與染色質(zhì)構(gòu)型改變,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)與DNA的相互作用; 三是組蛋白乙?；?去乙?；鳛樘厥庑盘?被其它蛋白質(zhì)因子識別并影響它們的活動,從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控,Model of a histone deacetylase complex,組蛋白去乙?；概c癌癥,HDAC缺陷也可導(dǎo)致與致癌相關(guān)的表型，當(dāng)HDAC過量或HAT的數(shù)量減少時(shí)，組蛋白乙?；钠胶鈱⑵蛉ヒ阴；?，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)異常。在白血病中，幾種轉(zhuǎn)錄因子由于異常招募(recruit)HDAC而抑制特定基因的表達(dá)。 例如，來源于急性前髓細(xì)胞白血病(APL)患者的細(xì)胞系中有HDAC活

34、性異常招募的現(xiàn)象。在APL患者中由于易位產(chǎn)生的融合癌基因產(chǎn)物通過招募HDAC而抑制轉(zhuǎn)錄。APL是急性骨髓白血病(AML)的一種普通形式。在骨髓的前髓細(xì)胞階段積累骨髓前體導(dǎo)致白細(xì)胞增多和出血。,HDAC抑制劑分為六大類，其中丁酸和制滴菌素(TSA)有著廣泛的應(yīng)用。丁酸是第一個(gè)被驗(yàn)證的HDAC抑制劑，已被成功地應(yīng)用于癌癥治療的實(shí)驗(yàn)性研究，并有一定的療效，但它發(fā)揮作用所需濃度較大，另外半衰期較短，因此它的應(yīng)用受到很大的限制。 而另一類應(yīng)用廣泛的抑制劑為氧肟酸類，如TSA和SAHA，它們的特異性較強(qiáng)，所需濃度較低，因此應(yīng)用較廣。已有幾種抑制劑進(jìn)行了期和期臨床試驗(yàn)，包括丁酸SAHAMS 275CI 99

35、42-丙基戊酸proxamide和縮肽。 用HDAC抑制劑對幾種類型的白血病和實(shí)體瘤進(jìn)行治療，效果非常好，很少或沒有副作用.這說明與傳統(tǒng)的化療藥物相比，HDAC抑制劑具有較大的優(yōu)勢和更加廣泛的應(yīng)用前景。,第四節(jié)蛋白質(zhì)的前體加工,原核生物中肽鏈起始合成時(shí)，N端為甲酰甲硫氨酸，真核肽鏈合成時(shí)N端是甲硫氨酸，但是成熟的蛋白質(zhì)中N端并無甲酰甲硫氨酸，大多數(shù)蛋自質(zhì)的N端也不是甲硫氨酸。 在生物合成過程中新生的肽鏈N端由去甲酞基酶去除甲酰甲硫氨酸殘基的甲?；彪拿溉コ齆端甲硫氨酸或N端某些氨基酸殘基。 一些分泌性蛋白質(zhì)、激素及酶最初合成的是不具有生物活性的前體，如白蛋白原、胰島素原等。蛋白質(zhì)前體要經(jīng)過蛋

36、白酶切割，去除一部分肽段后才具有活性。 它可以分為兩種類型：蛋白質(zhì)前體在細(xì)胞內(nèi)被加工成有生物活性的蛋白質(zhì)，然后分泌到胞外；蛋白質(zhì)前體被分泌到胞外或消化道，被蛋白酶加工成有生物活性的蛋白質(zhì)，如前膠原分子活化為膠原分子，胰蛋白酶原激活等。,蛋白質(zhì)前體的加工,在哺乳動物細(xì)胞中有一大類內(nèi)切蛋白酶如弗林蛋白酶(furin)，前激素轉(zhuǎn)換酶PC1、PC2和PC3等。它們能識別蛋白質(zhì)前體中ArgArg、LysArg、LysLys等雙堿性氨基酸殘基序列。在該序列的C端切斷肽鏈，此外還可能伴有其他酶切除蛋白質(zhì)前體兩末端的一些氨基酸殘基。 蛋白質(zhì)前體通過這種方式加工成有生物活性的蛋白質(zhì)。內(nèi)切蛋白酶的功能相同，但有不

37、同的分工。弗林蛋白酶分布在各種類型的細(xì)胞中，負(fù)責(zé)組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)前體加工，例如白蛋白前體被它切割，去除N端肽段后成為白蛋白。前激素轉(zhuǎn)移酶PC則負(fù)責(zé)分泌受調(diào)控的激素前體切割，如胰島素原的加工。,Structures of Furin and Kexin,Kex2 protease,1，多蛋白的加工,哺乳動物體內(nèi)的多肽激素及神經(jīng)肽生物合成時(shí)常被合成在一個(gè)包含有一種或多種多肽激素的多個(gè)拷貝的大前體中。該大前體稱為多蛋白，例如前阿片促黑皮質(zhì)素（POMC）前腦啡肽等。它們被內(nèi)切蛋白酶加工成成熟的多肽激素。 在不同的組織中相同的多蛋白可被加工成不同的多肽激素，呈現(xiàn)組織特異性，例如POMC在垂體前葉中被加

38、工成ACTH相-促脂解素(-LPH)，在垂體中間葉中被加工成-和-促黑素（-MSH，-MSH）、中間葉促皮質(zhì)樣肽、-促脂解素和-內(nèi)啡肽。 這些肽類激素的分子量比較小，如若單獨(dú)表達(dá)既不容易又不經(jīng)濟(jì)。生物體通過多蛋白加工的方式表達(dá)低分子量激素和神經(jīng)肽可提高表達(dá)效率。,2，胰島素原的加工,胰島素是胰島P細(xì)胞分泌的一種激素。在生物合成過程中有N端信號肽的合成，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，信號肋的切除，二硫鍵的形成與重排，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膠中正確折疊成胰島素原等過程。 胰島素原只有一條肽鏈，在分泌小泡中被PC2和PC3切割，去除中間的肽段(C肽)產(chǎn)生A鏈與B鏈，兩者由2個(gè)二硫鍵相連。B鏈C端被羧肽酶加工，切除2個(gè)精氨酸殘基，形成

39、成熟的胰島素。,為何胰島素生物合成先是合成胰島素原，然后再加工成胰島素?實(shí)驗(yàn)證明胰島素肽鏈的正確折疊依賴于C肽鏈中包含的信息，因此，成熟胰島素的形成必須經(jīng)過胰島素原階段。 其次胰島素分泌是受調(diào)控的，胰島素原的加工由PC2和PC3負(fù)責(zé)，可能是調(diào)控胰島素分泌的環(huán)節(jié)。,3，血管緊張素II的來源,腎臟是由無數(shù)個(gè)“腎單位”組成的，每個(gè)“腎單位”又由腎小球和腎小管組成，腎小球有入球小動脈和出球小動脈。 在腎小球入球動脈的特殊細(xì)胞（醫(yī)學(xué)上稱球旁細(xì)胞）分泌腎素；腎素可使肝臟合成的血管緊張素原生成血管緊張素I；血管緊張素I在一個(gè)特殊酶的作用下轉(zhuǎn)變成血管緊張素II。,血管緊張素II是體內(nèi)一個(gè)活性很強(qiáng)的物質(zhì)，其作用

40、包括三方面： 第一，使小動脈平滑肌收縮，外周血管阻力增加。 第二，刺激腎上腺一個(gè)叫皮質(zhì)球狀帶的部位分泌醛固酮，醛固酮是保鈉保水的物質(zhì)，繼而引起血容量增加，以上兩方面的作用共稱為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)。 第三，興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)，使去甲腎上腺素分泌增加，使血管收縮。 以上三方面作用導(dǎo)致血壓升高。再通過復(fù)雜的變化，血管緊張素II變成血管緊張素III，并使生物活性作用減弱或消失。,腎素是一種蛋白水解酶，可水解血中血管緊張素原(分子量為60000的2球蛋白)，使Lue10Val11l肽鍵斷裂，成為血管緊張素I(Angiotensin l)，這是一種沒有生理活性的十肽，再在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angi

41、otensin Converting Enzyne，ACE)作用下，脫去二肽，轉(zhuǎn)為八肽，即血管緊張素II (Angiotensin II)，是一種很強(qiáng)的血管收縮劑，使血壓升高。 于是ACE就成為研究的靶酶。通過對該酶的抑制，使血管緊張素I不能轉(zhuǎn)成血管緊張素II，血壓便能保持正常，因而構(gòu)成了一類抑制ACE的抗高血壓藥。,4，腫瘤壞死因子-,腫瘤壞死因子-（TNF-）是近年來研究較深入，應(yīng)用較廣泛的一種新型細(xì)胞因子。腫瘤壞死因子主要由活化的單核一巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。由前者產(chǎn)生的為腫瘤壞死因子，后者產(chǎn)生的為腫瘤壞死因子。 二者的作用和結(jié)構(gòu)大同小異。由于它能殺死惡性腫瘤細(xì)胞，科學(xué)家們對其產(chǎn)生和生

42、物學(xué)作用進(jìn)行了大量的研究。TNF-的生物活性部分是蛋白質(zhì)，含糖量極微或不含糖。TNF-的分子量和含糖量隨動物種系不同而異。人的TNF-是由3個(gè)分子量為17,000的單體構(gòu)成，單體呈片層結(jié)構(gòu)，他們之間通過一個(gè)二硫鍵共價(jià)組成活性復(fù)合體。不同種屬動物來源的TNF-，在蛋白質(zhì)組成的一級結(jié)構(gòu)上具有極高的同源性。,TNF-是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的一種細(xì)胞因子。TNF-不僅對腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒/細(xì)胞溶解、抑制增殖等作用，還影響許多類型細(xì)胞包括心肌細(xì)胞的生長、分化；作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管損傷和血栓形成。 另外，還能誘導(dǎo)心臟手術(shù)體外循環(huán)中的炎癥反應(yīng)，并與心功能不全、肺水腫等臨床癥狀密切相關(guān)，在免疫-炎癥協(xié)調(diào)的

43、信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起重要作用。,人TNF-前體由233個(gè)氨基酸殘基組成，含76個(gè)氨基酸殘基的信號肽，切除信號肽后成熟型TNF -為157氨基酸殘基，非糖基化，第69位和101位兩個(gè)半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。 小鼠TNF-前體為235氨基酸殘基，信號肽79氨基酸殘基，成熟的小鼠TNF-分子量為17kda，由156個(gè)氨基酸殘基組成，第69位和100位兩個(gè)半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵，有一個(gè)糖基化點(diǎn)，但糖基化不影響其生物學(xué)功能。 最近有人報(bào)道通過基因工程技術(shù)表達(dá)了n端少2個(gè)氨基酸（val、arg）的155氨基酸人TNF -，具有更好的生物學(xué)活性和抗腫瘤效應(yīng)。,腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(TACE),TACE為一含鋅

44、的內(nèi)肽金屬蛋白酶,其多肽序列與(嵌于細(xì)胞膜表面的蛇毒金屬蛋白酶家族)和(基質(zhì)金屬蛋白酶家族)有些相似,尤其是的多肽折疊和含鋅的催化區(qū)環(huán)境與蛇毒金屬蛋白酶相似,故被歸類為哺乳類家族中的新成員,其生理催化功能以前未曾鑒定。,Models for actions of ADAM proteases.,5，前內(nèi)皮素原的加工,內(nèi)皮素(ET)是自80年代以來發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管生物活性肽,前內(nèi)皮素原由203個(gè)氨基酸組成,被內(nèi)肽酶水解為38個(gè)(人)或39個(gè)(豬)氨基酸組成的中間產(chǎn)物大ET(bigendothelin),后者再由內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶(ECE)加工形成由21個(gè)氨基酸組成的成熟ET,即體內(nèi)有活性的ET。 ECE是其生物合成過程中的關(guān)鍵酶,在調(diào)節(jié)體內(nèi)ET生物學(xué)活性上起極重要的作用。肺循環(huán)血管平滑肌上含有大量高親和力的ET受體,而ECE分布與ET受體的分布具有平行關(guān)系,故ET及ECE對肺循環(huán)血液動力學(xué)有著不可忽視的影響。,酸性內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶,在豬的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在有一種酸性ECE,其轉(zhuǎn)換活性的最適pH值為4.0。在牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中存在有兩種ECE,其最適pH值分別為3.0和7.0。 pH值為3.0的ECE是一種酸性ECE,該酶活性可被酸性蛋白酶抑制劑抑胃肽A完全抑制,而不被其它抑制劑包括Phosphoramido