4免疫球蛋白

1、第四章 免疫球蛋白,概述 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) 免疫球蛋白的功能 五類(lèi)免疫球蛋白的特性與功能 人工制備抗體,概述,抗體（antibody，Ab）：是能與抗原發(fā)生高特異性和高親和性結(jié)合的糖蛋白。主要存在于血清等體液中，也被稱為“免疫球蛋白”。 B細(xì)胞識(shí)別抗原后活化、增殖、分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌,生物學(xué)功能上的概念,免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig） 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。,Ab與Ig的聯(lián)系 1. 所有的Ab都是Ig 2. Ig并非都是Ab,分泌型（secreted Ig，sIg） 膜型（membrane Ig，mIg）,化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念,第一節(jié) 免疫球蛋白

2、的結(jié)構(gòu),免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu) 免疫球蛋白的功能區(qū) 免疫球蛋白的水解片段 J鏈和分泌片,免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),四肽鏈分子，即由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過(guò)鏈間二硫鍵連接而成的免疫球蛋白單體，呈“Y”形。,結(jié)構(gòu)域,Ig分子的四條鏈都可折疊為數(shù)個(gè)球形結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)是由幾股多肽鏈折疊形成的兩個(gè)反向平行的片層。這種折疊稱為免疫球蛋白折疊。具有這類(lèi)獨(dú)特折疊結(jié)構(gòu)的分子被統(tǒng)稱為免疫球蛋白超家族。,重鏈和輕鏈,重鏈（heavy chain，H鏈）：5075KDa，約含450550個(gè)氨基酸殘基；根據(jù)H鏈恒定區(qū)抗原性的差異可將其分為、 五類(lèi)；與L鏈組成完整的Ig分子，分別稱為IgM、IgG、IgA、IgD和

3、IgE。 亞類(lèi)：IgG1-IgG4；IgA1,IgA2 鉸鏈區(qū)氨基酸組成，重鏈二硫鍵數(shù)目，位置不同,重鏈和輕鏈,輕鏈（light chain，L鏈）：25KDa，約由214個(gè)氨基酸殘基組成；分為和兩型。 正常血清Ig ：2：1 亞型：1 4 鏈恒定區(qū)個(gè)別氨基酸的差異,可變區(qū)和恒定區(qū),通過(guò)分析不同免疫球蛋白重鏈和輕鏈的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)重鏈和輕鏈靠近N端的約110氨基酸的序列變化很大，稱為可變區(qū)（variable region，V區(qū) ） 靠近C端的其余氨基酸序列相對(duì)穩(wěn)定，稱為恒定區(qū)（constant region，C區(qū)）,可變區(qū),可變區(qū)（V區(qū)）位于Ig分子的N端， 約占輕鏈的l/2（VL）和重鏈（

4、VH） 的1/4或l/5；它決定了抗體與抗原 結(jié)合的特異性； 在VL和VH中某些局部區(qū)域的氨基酸組成與排列具有更高的變化程度，此為高變區(qū)（hypervariable region, HVR）； 高變區(qū)即是抗體與抗原（決定簇）特異性結(jié)合的位置，又稱為互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region, CDR）； 在V區(qū)中非HVR部位的氨基酸組成和排列相對(duì)比較保守，稱為骨架區(qū)（framework region）。,恒定區(qū),C區(qū)位于Ig分子的C端，約占輕鏈的l/2（CL）和重鏈的3/4或4/5（CH）； 在同一種屬動(dòng)物中，同一類(lèi)別Ig重鏈和同一型輕鏈的C區(qū)氨基酸組成和

5、排列順序比較恒定，故稱恒定區(qū)。同一種屬的個(gè)體，所產(chǎn)生針對(duì)不同抗原的同一類(lèi)別Ig，其C區(qū)氨基酸組成和排列順序比較恒定，其免疫原性相同,鉸鏈區(qū),并非獨(dú)立的功能區(qū)，位于CH1和CH2之間，包括重鏈鏈間二硫鍵。該區(qū)富含脯氨酸（構(gòu)成膠原纖維的重要成分），具柔韌性，不形成螺旋，易于伸展、轉(zhuǎn)動(dòng)。特點(diǎn)： 使可變區(qū)的抗原結(jié)合點(diǎn)盡量與兩個(gè)抗原決定簇發(fā)生互補(bǔ)； 使Ig變構(gòu)，暴露補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)； 對(duì)蛋白酶敏感，Ig被水解易在此區(qū)發(fā)生裂解。,J鏈和分泌片,J鏈（joining chain）：存在于二聚體分泌型IgA和五聚體IgM中。分子量約15KD；富含半胱氨酸。 作用：穩(wěn)定多聚體。 分泌成分（secretory comp

6、onent，SC）或分泌片（secretory piece，SP）：分泌型IgA上的一個(gè)輔助成分，分子量約 75KD，由粘膜上皮細(xì)胞合成，并在IgA二聚體形成后通過(guò)二硫鍵連接到免疫球蛋白分子上，分泌至粘膜表面。 作用：穩(wěn)定分泌型IgA的結(jié)構(gòu)，使之避免蛋白酶的消化水解作用。,免疫球蛋白的水解片段,木瓜蛋白酶水解片段 胃蛋白酶水解片段,免疫球蛋白的異質(zhì)性,不同抗原表位刺激機(jī)體所產(chǎn)生的不同類(lèi)型的免疫球蛋白分子，其識(shí)別抗原的特異性不同，其重鏈類(lèi)別和輕鏈型別也有差異。 不同抗原表位誘導(dǎo)的同一類(lèi)型的免疫球蛋白，其識(shí)別抗原的特異性不同。,免疫球蛋白的類(lèi)型,類(lèi)（class）：在同一種屬的所有個(gè)體內(nèi)，Ig重鏈C

7、區(qū)所含抗原表位不同，據(jù)此可將重鏈分子分為五種，Ig分為五類(lèi)。 亞類(lèi)（subclass）:同一類(lèi)免疫球蛋白其重鏈的抗原性及二硫鍵數(shù)目和位置不同，據(jù)此可將Ig分為亞類(lèi)。IgG1-IgG4,IgA1,IgA2 型（type）：同一種屬所有個(gè)體內(nèi)，根據(jù)Ig輕鏈C區(qū)所含抗原表位的不同分為兩種，免疫球蛋白分為兩型。 亞型（subtype）：同一型免疫球蛋白中，根據(jù)輕鏈C區(qū)N端氨基酸排列的差異分為亞型。,免疫球蛋白的類(lèi)型,類(lèi) 根據(jù)同一種屬所有個(gè)體Ig重鏈C區(qū)抗原性的差異，分五類(lèi)：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 亞類(lèi) 根據(jù)同一類(lèi)Ig重鏈抗原性及二硫鍵數(shù)目和位置不同，分為亞類(lèi)：IgG1IgG4，IgA1

8、和IgA2,型 根據(jù)同一種屬所有個(gè)體Ig輕鏈C區(qū)抗原性的差異，分為和兩型。 亞型 根據(jù)同一型Ig輕鏈C區(qū)N端AA排列的差異，又分為不同亞型。,內(nèi)源性因素免疫球蛋白的血清型,同種型：同一種屬所有個(gè)體Ig共有的特異性抗原表位,為種屬型標(biāo)志 C區(qū) 同種異型：同一種屬不同個(gè)體Ig的不同特異性抗原表位,為個(gè)體型標(biāo)志 C區(qū)和V區(qū) 獨(dú)特型：每個(gè)Ig特有的抗特異性原表位,又稱為獨(dú)特位（每一Fab段5-6個(gè)）,Ig分子上有三類(lèi)不同的抗原表位，分別為:,同種型（isotype） 種屬型標(biāo)志，Ig C區(qū) 同種異型（allotype） 個(gè)體標(biāo)志，Ig C區(qū) 獨(dú)特型 （idiotype）每個(gè)Ig分子所特有 獨(dú)特位（Id

9、) HVR/CDR/Id,抗體與抗原的相互作用,高變區(qū)和抗原表位 表面互補(bǔ)方式 多種作用力參與 親和常數(shù) 抗體的多價(jià)性,免疫球蛋白的功能區(qū),構(gòu)成: Ig分子每一肽鏈內(nèi)部由大約110個(gè)氨基酸形成一個(gè) 亞單位，氨基酸的序列具有相似性或同源性，其內(nèi) 由鏈內(nèi)二硫鍵構(gòu)成肽環(huán)，稱為功能區(qū)。 功能： （1）VL和VH是與抗原結(jié)合的部位； （2）CH和CL具有某些同種異型（allotype）的遺傳標(biāo)記； （3）IgG的CH2 和IgM的CH3具有補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)補(bǔ)體 經(jīng)典激活途徑； （4）IgG可通過(guò)胎盤(pán)； （5）IgG的CH3和IgE的CH 4可與多種細(xì)胞膜表面的FcR結(jié) 合，介導(dǎo)不同生物學(xué)效應(yīng)。,第二節(jié)

10、免疫球蛋白的功能,識(shí)別并特異性結(jié)合抗原 激活補(bǔ)體 結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體 穿過(guò)胎盤(pán)和黏膜,一、識(shí)別并特異性結(jié)合抗原 V區(qū),中和毒素 中和病毒 抑制細(xì)菌粘附 到宿主細(xì)胞,二、激活補(bǔ)體 C區(qū),經(jīng)典途徑 旁路途徑,三、結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體 C區(qū),調(diào)理作用 抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 介導(dǎo)I型超敏反應(yīng),四、穿過(guò)胎盤(pán)和黏膜 C區(qū),在人類(lèi)IgG是唯一可通過(guò)胎盤(pán)從母體進(jìn)入胚胎的抗體。 胎盤(pán)母體一側(cè)的滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)一種特異性IgG輸送蛋白，稱為FcRn。 IgG可選擇性地與FcRn結(jié)合，從而轉(zhuǎn)移到滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)，并主動(dòng)進(jìn)入胎兒血循環(huán)中。 是一種重要的自然被動(dòng)免疫機(jī)制，對(duì)于新生兒抗感染有重要作用。,第三節(jié)

11、五類(lèi)免疫球蛋白的特性與功能,IgG IgM IgA IgD IgE,IgG,血清中含量最高(75%80%) 半衰期2023天，再次免疫應(yīng)答的主要抗體 出生后3個(gè)月開(kāi)始合成，之前靠母體IgG通過(guò)胎盤(pán)給胎兒 抗感染的主要抗體，自身抗體, 、型超敏反應(yīng)的抗體 激活補(bǔ)體、調(diào)理作用、ADCC,IgM,五聚體存在于血清中，分子量最大 單體表達(dá)于B細(xì)胞表面，構(gòu)成BCR 天然的血型抗體為IgM 個(gè)體發(fā)育中最早合成和分泌的Ig 初次免疫應(yīng)答時(shí)最早產(chǎn)生的Ig 很強(qiáng)的激活補(bǔ)體能力和調(diào)理作用,IgA,血清型IgA為單體，存在于血清中 分泌型IgA為雙體，存在于外分泌液中 參與粘膜局部免疫，初乳中sIgA對(duì)嬰兒發(fā)揮自然

12、被動(dòng)免疫,IgD,生物學(xué)作用不清楚 膜結(jié)合型IgD（mIgD）是B細(xì)胞分化發(fā)育成熟的標(biāo)志,IgE,血清中含量最低(0.002%) 親細(xì)胞抗體，與嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面IgE的Fc受體(FcRI)結(jié)合，介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的發(fā)生 與抗寄生蟲(chóng)免疫有關(guān),人工制備抗體,多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體,多克隆抗體（pAb）,天然抗原分子中常含有多種不同抗原表位，刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆，產(chǎn)生針對(duì)多種不同抗原表位的多種不同抗體的混合物。 特點(diǎn)： 作用全面，來(lái)源廣泛，制備簡(jiǎn)單； 特異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)。,單克隆抗體,單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb） 借助（小鼠）B細(xì)胞雜交

13、瘤技術(shù)，由單個(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的、高度均一的（屬于同一類(lèi)、亞類(lèi)、型別）、單一特異性（僅針對(duì)特定抗原表位）的抗體。,Georeges Kohler 1946-,Cesar Milstein 1927- Nobel Prize in 1984,基因工程抗體,又稱重組抗體：借助DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，在基因水平對(duì)Ig分子進(jìn)行切割拼接和修飾，重新組裝成新型抗體分子。,抗體片段及其衍生的各種形式,抗體片段的基本形式 ：Fab ，單鏈抗體 抗體衍生的其他形式 ：雙特異抗體 ，雙功能抗體,抗體片段的基本形式,Fab ：將雜交瘤單抗的輕鏈和重鏈的VH+CHI基因克隆入同一載體進(jìn)行表達(dá)，在細(xì)

14、菌中表達(dá)的Fab和酶解獲得的Fab片段具有同樣的親和力，但其大小只有完整Ig分子的1 3左右 單域抗體的Fv(VH和VL)就有抗原結(jié)合能力，細(xì)菌中表達(dá)的VH和VL能結(jié)合在一起成Fv，但不夠穩(wěn)定。在VH和VL間用一條短肽使之相聯(lián)就是單鏈抗體(single domain antibody),抗體衍生的其他形式,雙特異抗體 (bispecific antibody，BsAb) ： 具有兩種抗原特異性的抗體片段。兩個(gè)特異性不同的抗體或抗體片段聯(lián)在一起的雙分子，一端針對(duì)腫瘤或病原體抗原，另一端針對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的表面抗原 雙功能抗體 (bifunctional antibody) ：有特異識(shí)別和效應(yīng)分子功能的

15、分子。將Ig的結(jié)構(gòu)域通過(guò)基因工程技術(shù)和其他蛋白相聯(lián) ，常用免疫毒素相聯(lián)，以進(jìn)行直接的導(dǎo)向殺傷,嵌合抗體和重構(gòu)抗體,嵌合抗體 (chimeric antiboy)：主要特點(diǎn)是完整抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是鼠源的，而C區(qū)是人源的 重構(gòu)抗體(reshaped antibody) ：也稱CDR植入抗體(CDR grafting antibody)，是將鼠源的3個(gè)CDR取代人抗體中相應(yīng)的3個(gè)CDR部位，幾乎是百分之百人源化，所以也稱為人化抗體,噬菌體抗體庫(kù),20世紀(jì)90年代開(kāi)始建立一種避開(kāi)體內(nèi)免疫系統(tǒng)，在體外建立一個(gè)相應(yīng)于體內(nèi)B細(xì)胞庫(kù)的抗體庫(kù)，具有各種各樣的特異性抗體，從中用抗原篩選所需的抗體 將克隆的人AbV區(qū)基因與一種噬菌體DNA上的基因III或基因VIII精確連接，轉(zhuǎn)染細(xì)菌后在其膜表面表達(dá)Fab段-噬菌體外殼蛋白的融合蛋白。,該技術(shù)的成功主要基于兩點(diǎn)： 一是構(gòu)建大容量的組合文庫(kù)(combinatorial library)，建立一個(gè)體外的抗體庫(kù) 二是建立一個(gè)高效的篩選系統(tǒng)-噬菌體抗體庫(kù) 建庫(kù)時(shí)一般采用淋巴細(xì)胞固有的V基因，另一種策略是使用人工合成的方法，應(yīng)用寡核苷酸隨機(jī)合成等方法變化部分或全部CDR區(qū)的序列，構(gòu)成巨大的抗體庫(kù),人Ig基因組小鼠的構(gòu)建和應(yīng)用,用人Ig基因組取代小