牛奶中酪蛋白的分離與鑒定PPT課件.ppt

1、牛奶中活性物質(zhì)的分析,1,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1牛奶中水分含量的測(cè)定 2牛奶中粗脂肪的提取與測(cè)定,3牛奶中酪蛋白的提取 4蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,2,（1）牛奶中水分含量的測(cè)定,水分是食品分析的重要項(xiàng)目之一。水分測(cè)定對(duì)于計(jì)算生產(chǎn)中的物料平衡，和實(shí)行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為69.7%-92.5%，鮮菜為79.7%-97.1%，鮮瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分隨品種不同略有差異，一般為32-42% 水分測(cè)定法通?？煞譃橹苯臃ê烷g接法兩類。 利用水分本身的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)測(cè)定水分的方法，叫做直接法，如重量法，蒸餾法和卡爾.費(fèi)休法等； 利用食品的

2、比重，折射率，電導(dǎo)，介電常數(shù)等物理性質(zhì)測(cè)定水分的方法，叫做間接法。測(cè)定水分的方法要根據(jù)食品的性質(zhì)和測(cè)定目的來(lái)選定,3,一 重量法,凡操作過(guò)程中包括有稱量步驟的測(cè)定方法，統(tǒng)稱為重量法，如烘箱干燥法，紅外線干燥法，干燥劑法等。 烘箱干燥法 在一定溫度和壓力條件下，將樣品加熱干燥，以排除其中水分的方法，叫做烘箱干燥法。它包括常壓烘箱法和真空烘箱干燥法。這種測(cè)定方法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，但操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用范圍較廣。 應(yīng)用本法測(cè)定水分的樣品應(yīng)符合下述條件： (1)水分是唯一的揮發(fā)物質(zhì)； (2)水分的排除情況很完全； (3)食品中其他組分在加熱過(guò)程中由于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而引起的重量變化可以忽略。,4,二 材料與儀器,材料 全

3、脂牛奶 層析濾紙 器材 常壓電熱烘箱 干燥器 電子分析天平,5,三 操作步驟,取一張12cm*12cm 70過(guò)夜烘干的層析濾紙，稱重，記為m1。準(zhǔn)確稱取一定量牛奶m2，滴于濾紙上，70 烘干后稱重，記為m3。計(jì)算水分含量。 干物質(zhì)質(zhì)量m4= m3 - m1 水分含量（%）=（ m2-m4）/m2100,6,（2）粗脂肪的定量測(cè)定索氏提取法 一 、目的要求 學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪的定量測(cè)定法索氏提取法,7,二、原理 脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸結(jié)合成的脂類化合物, 能溶于脂溶性有機(jī)溶劑。 本實(shí)驗(yàn)用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來(lái)，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量。整個(gè)提取過(guò)程均

4、在索氏提取器中進(jìn)行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點(diǎn)為30C -60 C的石油醚。用此法提取的脂溶性物質(zhì)除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。,8,三、 適用范圍與特點(diǎn),適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)水解處理過(guò)的，（結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài)），樣品應(yīng)能烘干，磨細(xì)，不易吸濕結(jié)塊。 此法經(jīng)典，對(duì)大多數(shù)樣品的測(cè)定結(jié)果比較可靠。但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)（816 h）溶劑用量大，需要專門的儀器,索氏提取器。,9,四 材料、試劑與器材 材料：全脂牛奶 試劑：乙醚 器材：索氏提取器、干燥箱、電子分析天平,10,索氏提取器構(gòu)造,11,五、操作方法 1抽提筒的準(zhǔn)備 2 抽提 將測(cè)定

5、完水分帶有干物質(zhì)的濾紙折成小包放入抽提筒，再放入索氏抽提器內(nèi)，連接已干燥至恒重（m5）的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無(wú)水乙醚，加量為接受瓶的23體積，于60水浴上加熱，使乙醚不斷的回流提取，一般視含油量高低提取612小時(shí)，至抽提完全為止（用濾紙?jiān)嚕?12,3 稱重,取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶?jī)?nèi)乙醚剩 1 2 ml 時(shí)，在水浴上蒸干，再于100105干燥 2小時(shí)，取出放干燥器內(nèi)冷卻30分鐘，稱重，并重復(fù)操作至恒重（m6）。 取出濾紙包，于戶外晾至無(wú)乙醚味，置入恒溫箱內(nèi)，烘干，然后移入干燥缸內(nèi)冷卻后稱重，重復(fù)操作至恒重（m7）。,13,六 結(jié)果處理,方法一 脂肪()(m6-m5) / m4

6、100 m6接受瓶和脂肪的質(zhì)量，g； m5接受瓶的質(zhì)量，g； m4樣品的質(zhì)量(如為測(cè)定水分 后的 樣品質(zhì)量計(jì))，g。,方法二 脂肪()(m3-m7) / m4 100 m3未抽提濾紙包的質(zhì)量，g； m7抽提后濾紙包的質(zhì)量，g； m4樣品的質(zhì)量(如為測(cè)定水分 后的 樣品質(zhì)量計(jì))，g。,14,七、注意事項(xiàng) 乙醚為易燃有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持通風(fēng)并禁止任何明火。 抽提用的乙醚或石油醚要求無(wú)水、無(wú)醇、無(wú)過(guò)氧化物，揮發(fā)殘?jiān)康?。因水和醇可?dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶性鹽類、糖類等，使得測(cè)定結(jié)果偏高，被測(cè)樣品也要事先烘干。過(guò)氧化物會(huì)導(dǎo)致脂肪氧化，在烘干時(shí)也有引起爆炸的危險(xiǎn)。 裝樣品的濾紙筒一定要嚴(yán)密，不能往

7、外漏樣品，也但不要包得太緊影響溶劑滲透。放入濾紙筒時(shí)高度不要超過(guò)回流彎管，否則超過(guò)彎管的樣品中的脂肪不能提盡，造成誤差。,15,八、思考題 (1)本實(shí)驗(yàn)制備得到的是粗脂肪, 若要制備單一組分的脂類成分, 可用什么方法進(jìn)一步處理？ (2)本實(shí)驗(yàn)樣品制備時(shí)烘干為什么要避免過(guò)熱,16,（3）酪蛋白的提取 一 、目的要求 掌握一種提取酪蛋白的方法 掌握一種檢測(cè)牛乳質(zhì)量的方法,17,二 實(shí)驗(yàn)原理,酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，占乳蛋白的80%82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨

8、酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)可以檢測(cè)牛乳中是否摻假。 酪蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)由于靜電和為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，將牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就可從牛乳中分離出來(lái)。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被用來(lái)從酪蛋白粗制劑中將脂類雜志除去。,18,三 儀器、原料和試劑,儀器：溫度計(jì)、布氏漏斗、pH試紙、抽濾瓶、水浴鍋、燒杯、 量筒、表面皿、天平、離心機(jī)等 原料：市售全脂牛奶 試劑：無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚 pH4.7乙酸鈉緩沖液0.2mol/L 乙醇、乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（體積比）,19,四 實(shí)驗(yàn)步驟,1、酪蛋白等電點(diǎn)沉淀 將100mL牛乳放到5

9、00mL燒杯中，加熱到40，加入到同樣40的乙酸鈉緩沖液中，調(diào)pH達(dá)4.7。此時(shí)有絮狀的蛋白質(zhì)沉淀析出。將懸浮液冷卻至室溫，室溫放置分層 ，3000r/min離心15min，收集沉淀。 2、水洗 將pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍，洗滌粗制品三次，分別離心10分鐘，得到沉淀蛋白。 3、去脂 將粗制品中加入10ml無(wú)水乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗滌沉淀兩次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開(kāi)以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。準(zhǔn)確稱重后，計(jì)算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白質(zhì)量（g/100mL），并與理論產(chǎn)

10、量（3.5g/100mL）相比較，求出實(shí)際獲得百分率。,20,五 思考題,用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗滌蛋白質(zhì)的順序是否可以變換？為什么？ 試設(shè)計(jì)一個(gè)利用蛋白質(zhì)其他性質(zhì)提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn),21,六 離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng),離心機(jī)的工作原理：在離心力場(chǎng)的作用下，可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度，從而將不同的物質(zhì)分離。它是生化實(shí)驗(yàn)中提取、分離、純化的常用設(shè)備，操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是平衡。 注意事項(xiàng) 1.檢查內(nèi)、外套管應(yīng)完整不漏，洗凈離心管； 2.待離心的物質(zhì)裝入離心管的量不應(yīng)超過(guò)離心內(nèi)套管體積的2/3； 3.將一對(duì)離心管（含內(nèi)、外套管）放在臺(tái)秤上平衡； 4.檢查離心機(jī)正常后，將平衡好的離心管對(duì)稱的放在

11、離心機(jī)中； 5.蓋好離心機(jī)蓋，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，設(shè)置轉(zhuǎn)速與時(shí)間，開(kāi)始離心。注意一定不能超過(guò)離心機(jī)的最大離心速度！離心結(jié)束后，待離心機(jī)停止運(yùn)轉(zhuǎn)后，再打開(kāi)機(jī)蓋，取出離心管，不許用手強(qiáng)行使離心機(jī)停止轉(zhuǎn) 6用完后，將內(nèi)外套管洗凈，倒立放置，使其干燥，并在使用的登記薄簽名。 7.使用過(guò)程中，如出現(xiàn)故障，一定請(qǐng)本室的實(shí)驗(yàn)員排除，不許擅自處理,22,（4）蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法,一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)會(huì)用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,23,考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色，最大吸收峰改變

12、為595nm,考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測(cè)定的高敏感度（比Lowry法靈敏4倍） 在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料考馬斯亮藍(lán)結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。,二 實(shí)驗(yàn)原理,24,Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量,25,三 實(shí)驗(yàn)試劑與器材,試劑 0.9%NaCl溶液 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml） 染液：考馬斯亮藍(lán)G250（0.01%） 樣品液：酪蛋白溶液 器材 漩渦混合器 試管 吸管 容量瓶 量筒 電子分析天平 比色皿 722型分光光度計(jì),26,四、 操作方法 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制

13、作 取14支試管，分兩組按下表平行操作。 試管編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.9%NaCl溶液（mL）1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考馬斯亮藍(lán)試劑(mL) 4 4 4 4 4 4 4 蛋白質(zhì)濃度(g/mL) 0 10 20 30 40 50 60 A595nm 搖勻，1 h內(nèi)以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm處比色 OD595nm 以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,27,2. 酪蛋白濃度的測(cè)定 稱取一定量的酪蛋白，用0.9%NaCl溶液溶解定容至一

14、定體積（使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)）。測(cè)定方法同上，根據(jù)所測(cè)定的OD595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(g/mL)。,28,五 注意事項(xiàng),（1）如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5-20 min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵龠@段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。 （2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，但此復(fù)合物的吸附量可以忽略。測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。 （3）一些陽(yáng)離子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)影響，而大量的去污劑如SDS等會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定。,29,六 722型分光光度計(jì)使用方法,1調(diào)整 （1）將靈敏度旋鈕調(diào)至“

15、1”檔（放大倍率最?。?。調(diào)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器至所需波長(zhǎng)。 （2）開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)，指示燈亮，選擇開(kāi)關(guān)置于“T”，調(diào)節(jié)透光率100%T旋鈕使數(shù)字顯示100.0左右，預(yù)熱20min . 2校正 （1）打開(kāi)吸收池暗室蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)0% T旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，蓋上吸收池蓋，將參比溶液置于光路，使光電管受光，調(diào)節(jié)透光率100%T旋鈕，使數(shù)學(xué)顯示為“100.0”。 （2）如果顯示不到“100”，則可適當(dāng)增加電流放大器靈敏度檔數(shù)，但應(yīng)盡可能使用低檔數(shù)，這樣儀器將有更高的穩(wěn)定性。當(dāng)改變靈敏度 后必須重新校正“0”和“100”。 （3）按（1）連續(xù)幾次調(diào)整“00.0”和“100.0”后，如將選擇開(kāi)關(guān)置于“A”，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”，即可進(jìn)行下面吸光度A的測(cè)量；如將選擇開(kāi)關(guān)置于“C”，將標(biāo)準(zhǔn)溶液推入光路，調(diào)節(jié)濃度旋鈕，使得數(shù)字顯示值為已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度數(shù)值，即可進(jìn)行下面濃度c的測(cè)量。,30,3測(cè)定 （） 吸光度的測(cè)量。將要測(cè)的試樣溶液推入光路，顯示值即為待測(cè)樣品的吸光度值。 （） 濃度c的測(cè)量。將要測(cè)c試樣溶液推入光路，即可讀出待測(cè)樣品的濃度值c。 4結(jié)束 測(cè)量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置。取出吸收池洗凈，晾干，存于專用盒內(nèi)。